酒精依賴大鼠不同戒斷期血漿食欲素A 水平變化與戒斷癥狀程度的相關性研究*

李子童，劉旭，李斌，陳旭**

（1.濟寧醫學院精神衛生學院，山東 濟寧 272067；2.山東省精神衛生中心成癮醫學科，山東 濟南 250014）

酒精依賴（Alcohol dependence）是由于飲酒所致的對酒精渴求的一種心理狀態，可呈連續性或周期性出現，以體驗飲酒的心理效應，在美國所有疾病中死亡率占2.6%[1]。臨床上酒依賴患者在完全或部分停止飲酒后所出現的一組戒斷癥狀如震顫、幻覺及意識障礙等，稱為酒精戒斷綜合征（alcohol withdrawal syndrome，AWS）。AWS 期間，自主神經功能亢進可以出現惡心、嘔吐、心率和血壓變化等軀體癥狀和體征，嚴重者還可出現癲癇和水電解質紊亂，最終導致死亡或腦損害[2，3]。食欲素A（orexin-A，OXA）是外側下丘腦神經元中的一種神經遞質，其在飲酒、進食、內分泌功能和睡眠/覺醒的調節中發揮重要作用[4]。近年來越來越多的國內外研究表明，OXA 可能在物質成癮方面發揮著重要作用。有動物研究發現[5]，大鼠海馬區有著相當豐富的OXA 受體，而使用orexin 受體拮抗劑SB-334867 可以通過作用于嗎啡依賴大鼠的海馬的背側區，來減少嗎啡戒斷癥狀中的牙齒打顫、身體發抖、腹瀉、上瞼下垂等一些軀體癥狀。同時臨床研究中顯示[6]，酒依賴患者的外周血中OXA 的蛋白表達和啟動子的甲基化同戒斷反應的嚴重程度呈負相關，即戒斷反應越強，外周血OXA 的蛋白表達和啟動子甲基化就越弱，這個結果可能提示外周OXA 的高水平抑制了其自身的合成。還有研究表明[7，8]，男性酒精依賴患者戒斷后的外周血漿OXA 水平顯著高于正常人，以及OXA 水平與患者的戒斷癥狀和心理渴求之間存在正相關性。故本研究將以建立酒精依賴大鼠模型為基礎，進一步觀察并驗證OXA 與AWS 的相關性，從而明確其對酒精依賴大鼠模型急性戒斷癥狀的影響及治療價值，為評估和治療AWS 提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

選取雄性SD 大鼠24 只[（250±10）g 左右，（6±1）周齡]，對其進行編號、稱重并依照隨機數字表法分為A、B、C 三組（各組n=8），A 組為對照組，B 組和C 組為實驗組。大鼠均由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。本研究經山東省精神衛生中心倫理委員會審核批準。

1.1.2 實驗試劑

使用75%醫用酒精配制成6%的酒精水溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒精依賴大鼠模型建立

每只大鼠單籠飼養，室溫控制在20～25 ℃，同時12 h 人工模擬晝夜交替，普通固體營養顆粒飼料，24 h 自由飲食。參照李菁等[9]人的方法，將實驗組飲水更換為含有6%的乙醇水溶液作為唯一引用水來源喂養28 d。對照組給予普通飲用水，自由進食。所有大鼠水源每3～4 d 更換1 次，每2 周稱重1 次，至實驗結束。

1.2.2 乙醇水溶液飲用量記錄

實驗組每次更換乙醇水溶液時，均記錄大鼠酒精水溶液消耗量，直至實驗結束匯總。

1.2.3 戒斷癥狀評分

參照李菁等[9]人的方法，使用《酒精依賴大鼠戒斷行為體征和聽源性癲癇發作評分標準》（表1）進行評估，三組大鼠喂養28 d 后，將實驗組籠內酒精水溶液更換為正常飲水，B 組和C 組分別于停酒后6 h、18 h，A 組于停水后6 h 進行戒斷癥狀評分。

表1 酒精依賴大鼠戒斷行為體征和聽源性癲癇發作評分標準

1.2.4 樣本采集

取血方式采用腹主動脈取血法，抓取大鼠后給予10%水合氯醛腹腔麻醉，待大鼠充分麻醉后將其固定于仰臥位實驗臺上，四肢用橡皮筋固定，切開腹部皮膚及筋膜，充分暴露大鼠腹腔尋找腹主動脈。使用靜脈采血針進行采血，EDTA 抗凝保存并離心處理（3000 r/min，10 min），取上層血漿500 μl 于離心管中-70 ℃凍存。

1.2.5 酶聯免疫吸附法測定（Elisa）樣本OXA 水平

使用雙抗體夾心法測定，恒溫箱孵育30 min 后再加入終止液15 min 內，在450 nm 波長處測定吸光度并讀數，每樣本均采用雙測法，取2 次測定的算術平均值作為OXA 最終測定濃度。上述樣本均進行雙測，取算術平均值作為最終測定結果。試劑盒購買自江蘇酶免實驗有限公司，按照說明書操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析，如符合正態分布，以（±s）描述，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；如不符合正態分布，則以[M（QL，QU）]描述，組間比較用Kruskal-Wallis H 檢驗，結果采用Bonferroni 法校正。OXA 濃度水平與戒斷癥狀評分相關性采用Spearman 相關分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 飲酒期間大鼠飲酒量和體重變化

B 組飲酒量與C 組比較[（958.75±89.83）ml vs（879.25±133.73）ml]，差異無統計學意義（P＞0.05）；每只大鼠平均每天飲酒量為32.82 ml/d，相當于攝入酒精1.58 g/d，見圖1。實驗前A 組體重為（247.41±7.67）g，與B 組 的（248.09±3.52）g 和C 組的（249.14±4.49）g 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；實驗結束A 組體重為（413.83±15.49）g，與B 組的（408.38±31.14）g、C 組的（427.35±17.22）g 比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖1 不同戒斷組大鼠飲酒量比較

圖2 三組大鼠體重變化比較

2.2 酒精戒斷后的酒依賴大鼠戒斷反應評分

在建模期間，大鼠性格溫順，不易激惹，體征正常。自撤除酒精后2 h 開始，大鼠開始出現較多的戒斷癥狀，如易激惹、具有攻擊性、打噴嚏等。將戒斷評分進行總體與分類比較，結果顯示B 組戒斷總分、分項評分與A 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；C 組戒斷總分與A 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但在分項比較中大鼠激惹性和尾巴強直兩項評分與A 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其余三項評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2、圖3。

圖3 各組大鼠戒斷評分比較

表2 撤除酒精后各組大鼠戒斷癥狀評分（n=8）

2.3 OXA 水平結果分析

將三組血漿OXA 測定結果進行對比，結果顯示B 組血漿OXA 濃度水平高于A 組和C 組，差異有統計學意義（P＜0.05），C 組OXA 水平也高于A 組，但差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠OXA 濃度水平比較

2.4 OXA 水平與戒斷癥狀評分、飲酒量及體重變化相關性

將B 組和C 組的OXA 水平與戒斷癥狀評分進行相關性分析，結果顯示OXA 水平與戒斷反應評分呈正相關性（r=0.70，P＜0.05），而與飲酒期間大鼠的體重變化、飲酒量無相關性（P＞0.05）。

3 討論

酒精戒斷綜合征是酒依賴患者的飲酒中斷，進而出現一系列精神及軀體癥狀，嚴重影響患者身心健康，也是戒除酒依賴的關鍵。目前，FDA 已批準了Orexin 受體拮抗劑用于治療失眠[10]，以及其他Orexin 受體拮抗劑在臨床應用研究，為治療AWS 提供了一個新思路。本研究通過建立酒精依賴大鼠模型，探討OXA 水平與酒精戒斷癥狀嚴重性的相關性，從而為防治AWS 探尋新的臨床線索。

3.1 飲酒期間大鼠飲酒量及體重變化

目前，酒依賴大鼠模型的建立多采用模擬酗酒者的方法，給予大鼠短期大量的酒精以達到酒依賴程度[11]。本研究采用長期給予大鼠低濃度酒精水溶液的方法建模，并同時設立同等健康對照大鼠，記錄大鼠的飲酒量與體重變化，結果顯示在僅改變飲水而其他喂養條件一致時，實驗組與對照組大鼠的體重變化之間無明顯差異，這表明長期飲用6%的低濃度酒精并不會影響大鼠的進食。因此，本研究分析實驗組大鼠出現的戒斷體征與OXA 濃度的差異，僅僅是由于長期飲酒所造成的。同時本研究對比了兩個實驗組的飲酒量，發現并無明顯差異，從而排除了實驗組之間的結果差異并非是由于酒精消耗量的不同引起的。

3.2 戒酒后大鼠的行為體征變化

既往曾有文獻報道[12，13]，酒依賴大鼠的戒斷癥狀在停酒后的24 h 內最嚴重，故本研究分別在實驗組停酒后的6 h、18 h 進行戒斷癥狀的評分。本研究采用改良后的評分標準進行評估，將每只大鼠放置于單獨安靜的場地中，每只評估時間不少于5 min。結果顯示，大鼠在停酒后6 h 時戒斷癥狀表現極為嚴重，戒斷行為體征明顯，如情緒燥鬧，易激惹，對外界刺激具有攻擊性，以及大部分大鼠聽源性癲癇發作持續時間大于90 s，而其中一只大鼠更是因癲癇發作導致死亡。至戒斷18 h 時，大鼠戒斷體征雖有緩解，但仍存在較為嚴重的聽源性癲癇發作。同時，實驗組的戒斷評分與對照組相比存在差異，說明了此方法建立酒精依賴大鼠模型是可靠的。

3.3 OXA 水平結果分析

研究表明，OXA 的水平濃度與酒精攝入量呈正相關，通過測定接受住院的AUD 患者外周血液中的OXA 濃度發現，相對于健康被試來說，患者的血液OXA 濃度水平有明顯增高，同時納入研究中的重度酒精依賴患者的血液OXA 濃度也高于中輕度成癮的個體[14]。本研究結果顯示，長期飲酒的大鼠體內擁有較高的OXA 水平，尤其是在停酒后6 h 大鼠血漿OXA 濃度水平與對照組存在差異。而隨著戒斷時間至18 h 左右，實驗組OXA 水平雖與對照組無統計學差異，但總體水平仍高于對照組。此結果說明，隨著戒斷時間延長，OXA 水平呈下降趨勢，這與國外動物實驗中觀察結果相一致[15，16]。于是可以提出猜測，長期的酒精攝入可能促進了食欲素mRNA 的表達，而高水平的OXA 因其在飲食方面的作用，又反過來促進酒精消耗，從而形成一種正反饋循環。總之，長期酒精在某種程度上促進了食欲素水平的上升。

3.4 OXA 與戒斷癥狀的關系

目前，臨床上對于AWS 的治療主要是通過苯二氮 類藥物（benzodiazepines，BZD）的替代治療，雖然也有人曾嘗試其他藥物治療AWS，如抗精神病藥物、抗驚厥藥及抗抑郁藥物等，但效果均不及BZD 明顯。本研究將實驗組的OXA 水平與戒斷評分進行相關性分析，結果表明二者之間存在正相關性。既往有研究表明[8，14]，酒精依賴男性患者戒斷癥狀重度的個體比起癥狀中度的個體有著更高的血液Orexin 水平，據此可以提出大膽推測，在酒依賴患者血中OXA 水平越高，戒斷癥狀可能就越嚴重，而通過應用Orexin 受體拮抗劑可能會減輕停酒后引起的戒斷體征，這仍需要進一步實驗來驗證。

本研究亦存在部分不足之處：首先，大鼠模型樣本量較少，可能對結果造成一定的局限性；其次，血漿中OXA 濃度水平含量較低，測定結果可能會有偏倚，較好的方法是采集大鼠腦脊液測定，但存在一定的技術困難；另外，腹主動脈采血法雖然簡便易行，但也同時令大鼠迅速失血死亡，進而導致本研究缺乏對同一大鼠的動態性評估。因此，未來仍需規劃更加嚴謹科學的方案進一步對本研究進行補充。

綜上所述，Orexin 系統可能在急性酒精戒斷反應中發揮重要作用，并可能是治療AWS 的潛在靶點。對于將來該方面的研究，可以考慮在大鼠戒斷時期利用Orexin 受體拮抗劑，觀察在阻斷食欲素受體作用后能否明顯緩解AWS 癥狀，從而進一步探討OXA 與AWS 癥狀的關系。