非小細胞肺癌組織中miR-605-5p、TNFAIP3表達水平及臨床意義

余鳳,李良,李鴻雁,楚鑫

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)主要起源于肺部腺體或支氣管黏膜[1],其早期無明顯癥狀,隨病情進展可表現為咳嗽等臨床癥狀,同時常因腫瘤遠處轉移而出現一系列并發癥,此時患者可能錯過最佳治療時機,預后相對較差[2]。因此,尋找能早期評估NSCLC患者預后的指標,對NSCLC的治療及改善患者近遠期預后是非常重要的。既往研究發現[3-4],微小RNA(microRNA,miRNA)可通過與靶基因信使RNA(mRNA)3’端非翻譯區結合在NSCLC細胞轉移、復發等過程中起關鍵性作用。微小RNA-605-5p(microRNA-605-5p,miR-605-5p)是miRNA中一員,其異常表達與NSCLC發病有關[5]。腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(tumor necrosis factor alpha induced protein 3,TNFAIP3)是內皮細胞經腫瘤壞死因子誘導后表達的編碼產物,可參與炎性反應、細胞分化等過程,在多種腫瘤的惡變過程中發揮重要作用[6]。研究證實,miR-605-5p可通過靶向TNFAIP3促進NSCLC發展[7]。但二者的靶向作用尚未在臨床研究中得到證實。因此,現分析NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3表達水平及其對患者預后的潛在評估價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年2月—2018年1月在東南大學附屬中大醫院江北院區行手術切除的NSCLC患者87例作為觀察對象。術中留取NSCLC組織及距其>3 cm的癌旁正常組織,并置于液氮中保存。男47例,女40例;年齡38～75(54.19±14.82)歲,≤54歲43例,>54歲44例;吸煙52例,無吸煙35例;腫瘤直徑:≤3 cm 46例,>3 cm 41例;組織類型:腺癌38例,鱗癌49例;TNM分期[8]:Ⅰ期19例,Ⅱ期36例,Ⅲ期32例;淋巴結轉移37例,無淋巴結轉移50例。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(ZDLS-臨床2014-04),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①符合NSCLC診斷標準,且經病理證實[6];②臨床病理資料完整;③均為首次確診患者且配合隨訪。(2)排除標準:①合并其他惡性腫瘤;②入組前接受抗腫瘤治療;③嚴重肝、腎功能障礙者;④合并其他肺部疾病。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 免疫組織化學法檢測TNFAIP3表達:NSCLC組織和癌旁正常組織標本經常規處理后,加入稀釋的兔抗人TNFAIP3單克隆抗體(批號KL-18641,購自上海魯汶生物科技有限公司)工作液,濃度為1∶100,其余檢測方法參照即用型高效免疫組織化學二抗試劑盒(批號YS09322B,購自上海雅吉生物科技有限公司)說明書操作,其中陽性對照和陰性對照分別為已知陽性切片、磷酸鹽緩沖液。由2位經驗豐富的病理科醫師共同對每張切片的染色結果進行判讀,(1)細胞染色強度評分:無顯色、弱顯色、中等顯色、強顯色分別為0、1、2、3分;(2)陽性染色的細胞比例:<5%、5%～20%、21%～50%、51%～75%、>75%分別為0、1、2、3、4分。以兩項評分的乘積<4分為TNFAIP3陰性,乘積≥4分為TNFAIP3陽性[9]。

1.3.2 實時熒光定量PCR法檢測miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達:取出液氮中保存的NSCLC和癌旁正常組織標本,采用Trizol試劑盒(批號HK-6013M,購自美國Invitrogen公司)提取總RNA,并依照TaqMan miRNA反轉錄試劑盒(批號931047,購自杭州市海基生物科技有限公司)說明書中的方法進行反轉錄,得到cDNA并置于-80℃冰箱保存。實時熒光定量PCR反應條件為:95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 47 s、56℃ 19 s,共運行45個循環。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,見表1。反應完成后,用2-△△Ct法分析并計算miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA的相對表達量。

表1 miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA引物序列Tab.1 miR-605-5p, TNFAIP3 mRNA primer sequences

1.3.3 預后隨訪:NSCLC患者術后第1天開始隨訪,隨訪至2023年1月31日,共隨訪5年。隨訪方式為打電話或門診復查,隨訪終點為患者死亡或隨訪結束。無失訪患者,計算總生存率。

2 結 果

2.1 NSCLC組織和癌旁正常組織中TNFAIP3表達比較 TNFAIP3主要表達于細胞漿,呈棕黃色或棕褐色顆粒,見圖1。NSCLC組織中TNFAIP3陽性率為25.29%(22/87),明顯低于癌旁正常組織的57.47%(50/87),差異有統計學意義(χ2/P=18.575/<0.001)。

注:紅色箭頭指示為TNFAIP3表達圖1 NSCLC組織中TNFAIP3表達(免疫組織化學染色,×200)Fig.1 TNFAIP3 expression in NSCLC tissue (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 NSCLC組織和癌旁正常組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達水平比較 NSCLC組織中miR-605-5p表達水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.01),TNFAIP3 mRNA表達水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.01),見表2。

表2 NSCLC組織和癌旁正常組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達水平比較Tab.2 Comparison of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression levels in NSCLC tissue and normal tissue adjacent to cancer

2.3 miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達在不同臨床/病理特征中差異比較 分別以NSCLC組織miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達水平均值1.86、0.51為界,將患者分為miR-605-5p低表達組42例(miR-605-5p<1.86)和miR-605-5p高表達組45例(miR-605-5p≥1.86),TNFAIP3 mRNA低表達組41例(TNFAIP3 mRNA<0.51)和TNFAIP3 mRNA高表達組46例(TNFAIP3 mRNA≥0.51);NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達與性別、年齡、吸煙、腫瘤直徑、組織類型無關(P>0.05);miR-605-5p高表達組TNM分期中Ⅲ期、有淋巴結轉移比例明顯高于miR-605-5p低表達組(P<0.01);TNFAIP3 mRNA低表達組TNM分期中Ⅲ期、有淋巴結轉移比例明顯高于TNFAIP3 mRNA高表達組(P<0.01),見表3。

表3 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA在不同臨床/病理特征中表達差異比較 [例(%)]Tab.3 Comparison of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression differences in different clinical/pathological features in NSCLC tissues

2.4 NSCLC組織中miR-605-5p與TNFAIP3 mRNA表達水平的相關性 NSCLC組織中miR-605-5p與TNFAIP3 mRNA表達水平呈負相關(r=-0.453,P<0.001)。

2.5 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達與患者生存的關系 NSCLC患者隨訪5年,生存34例(生存組),死亡53例(死亡組);miR-605-5p低表達組5年總生存率為52.38%(22/42),明顯高于miR-605-5p高表達組的26.67%(12/45),差異有統計學意義(χ2=6.034,P=0.014);TNFAIP3 mRNA低表達組5年總生存率為21.95%(9/41),明顯低于TNFAIP3 mRNA高表達組的54.35%(25/46),差異有統計學意義(χ2=9.557,P=0.002)。

2.6 生存組和死亡組NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達水平比較 死亡組NSCLC組織中miR-605-5p表達水平明顯高于生存組(P<0.05),TNFAIP3 mRNA表達水平明顯低于生存組(P<0.01),見表4。

表4 生存組和死亡組NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達水平比較Tab.4 Comparison of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression levels in NSCLC tissues between survival and death groups

2.7 影響NSCLC患者5年內生存的多因素分析 以NSCLC患者5年內生存情況為因變量(生存=0,死亡=1),以TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期=0,Ⅲ期=1)、淋巴結轉移(無=0,有=1)、miR-605-5p(低表達=0,高表達=1)、TNFAIP3 mRNA(高表達=0,低表達=1)為自變量,進行Logistic回歸分析,結果發現,TNM Ⅲ期、有淋巴結轉移、miR-605-5p高表達、TNFAIP3 mRNA低表達是影響NSCLC患者5年內生存的危險因素(P<0.01),見表5。

表5 影響NSCLC患者5年內生存的多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis on the 5-year survival of NSCLC patients

2.8 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達水平對患者5年內生存的預測價值 繪制NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA及二者聯合預測患者5年內生存的ROC曲線,并計算AUC,結果顯示:miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA及二者聯合預測患者5年內生存的AUC分別為0.761、0.837、0.910;二者聯合的AUC高于miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA各自單獨預測的AUC(Z=2.716、1.986,P=0.007、0.047),見圖2、表6。

圖2 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA預測患者5年內生存的ROC曲線Fig.2 Receiver operating characteristic of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA in NSCLC tissue predicting patients' survival within 5 years

表6 NSCLC組織中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達水平對患者5年內生存的預測價值Tab.6 Predictive value of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression levels in NSCLC tissue for 5-year survival of patients

3 討 論

miRNA是一類具有廣泛生物學功能的非編碼RNA,近年來研究顯示其在肺癌發生發展及放化療耐藥性中均扮演著重要角色,可通過對miRNA的調控為肺癌的治療提供新方向[10-11]。相關研究表明,miR-139-5p、miR-25-3p等在肺癌和癌旁組織中的表達存在差異[12-14]。Ye等[15]研究發現,miR-605高表達與NSCLC的發生、發展有關。但NSCLC和癌旁組織中miR-605-5p的表達是否存在差異尚不十分清楚。本研究結果發現,NSCLC組織中miR-605-5p表達水平明顯高于癌旁正常組織,與Ye等[15]研究結果類似,提示miR-605-5p表達上調可能與NSCLC發病有關。進一步研究發現,miR-605-5p高表達者TNM分期Ⅲ期及有淋巴結轉移比例較高,提示miR-605-5p表達變化與NSCLC惡變程度有關,可能原因是miR-605-5p高表達的NSCLC組織中癌細胞具有更強的侵襲和轉移能力,可加速NSCLC進展。本研究繪制以miR-605-5p表達水平均值為界值的Kaplan-Meier生存曲線,結果顯示與miR-605-5p高表達者比較,miR-605-5p低表達者具有較高的5年總生存率,提示檢測miR-605-5p表達可能有利于評估NSCLC患者遠期生存情況。此外,死亡患者的NSCLC組織中miR-605-5p表達水平較生存患者高,miR-605-5p高表達是影響NSCLC患者5年內生存的危險因素,且其可作為預測患者5年內生存的指標,提示miR-605-5p可能作為評估NSCLC患者生存的獨立預后指標。

TNFAIP3又稱為鋅指蛋白A20,含7個鋅指區的C和N末端區,首次發現于人臍靜脈內皮細胞[16-17]。TNFAIP3作為一種核因子-κB信號通路抑制劑,其在炎性反應相關的多種惡性疾病中有重要意義[18-19]。Sharif-Askari等[20]研究報道,乳腺癌組織中TNFAIP3呈低表達,且會影響乳腺癌患者預后。秦英[21]研究發現,彌漫大B細胞淋巴瘤病灶內TNFAIP3 mRNA表達量較對照組低,其低表達與患者淋巴瘤分期有關。本研究發現,NSCLC組織中TNFAIP3陽性率、TNFAIP3 mRNA表達水平均較癌旁正常組織低,同時發現TNFAIP3低表達者TNM分期Ⅲ期及有淋巴結轉移比例較高,提示TNFAIP3表達下調可能參與NSCLC發生、發展,與Sharif-Askari等[20]和秦英[21]的研究結果相似,可能原因是TNFAIP3作為癌癥抑制因子,其低表達會使NSCLC細胞惡性生物學行為增強,從而加快NSCLC惡性進展。Kaplan-Meier生存曲線結果顯示,TNFAIP3高表達者5年總生存率明顯高于TNFAIP3低表達者,提示TNFAIP3表達可能與NSCLC患者不良預后有一定關聯。同時死亡患者的NSCLC組織中TNFAIP3 mRNA表達水平明顯低于生存患者,TNFAIP3 mRNA低表達是影響NSCLC患者5年內生存的危險因素,且其預測患者5年內生存的AUC為0.837,進一步提示檢測TNFAIP3表達對判斷NSCLC患者預后有一定價值。ROC曲線結果還顯示,miR-605-5p聯合TNFAIP3 mRNA預測患者5年內生存的AUC高于二者單獨預測的AUC,提示聯合檢測miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表達水平,可能對判斷患者5年內生存情況更有意義。此外,Pearson相關分析發現,NSCLC組織中miR-605-5p與TNFAIP3 mRNA表達呈負相關,提示miR-605-5p和TNFAIP3 mRNA可能相互影響,在NSCLC患者預后中發揮作用,但具體作用機制需深入探討。

綜上所述,miR-605-5p在NSCLC組織中表達上調,TNFAIP3 mRNA表達下調,二者呈負相關,與NSCLC患者TNM分期、淋巴結轉移密切相關,均可能作為評估患者預后的重要指標,可為NSCLC的靶向治療提供新思路。但臨床影響NSCLC患者預后的因素較多,為驗證結果需擴大樣本繼續探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

余鳳:設計研究方案,實施研究過程,撰寫論文;李良:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;李鴻雁:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;楚鑫:進行統計學分析