多菌種聯合發酵降低醬油二次沉淀的研究

鄭二帥，曹 猛，梁蘭蘭，廖熙娜，李 孌

（廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東中山 528400）

醬油起源于中國，距今已有超過2 500年的歷史，在我國日常生活和食品工業中均扮演著極為重要的角色。隨著人們生活水平的提高，醬油以其滋味純鮮、醇厚的特性，已經成為佐餐點蘸、烹飪贈香添色的最佳幫手，成為家庭廚房中必不可少的調味品之一。醬油在經過加熱、沉淀、過濾后包裝銷售，在貨架期會有沉淀物析出，盡管不存在食品安全隱患，但會給消費者帶來不好的感官體驗，這種外觀質量的顯著差異嚴重影響消費者的購買選擇[1]。為了減少貨架期沉淀的產生，目前通用的方法是在灌裝包裝前采用多級沉淀過濾甚至膜過濾的方式，盡可能過濾掉沉降物及大分子物質，但過濾會帶來損耗增加、醬油增香大分子物質減少等不利影響，降低醬油的風味及口感[2]。

本文從醬油發酵根源進行研究，旨在利用各種菌株的優勢，從發酵結束后醬油體系的穩定性入手解決二次沉淀問題。米曲霉具有強大的產蛋白酶能力，黑曲霉產淀粉酶的能力較強，通過在制曲階段控制溫度，充分發揮兩種菌株的能力，使曲料在兩種菌種作用下發酵產生豐富的酶系，以促進大豆、小麥原料中的蛋白質、纖維、淀粉充分分解為氨基酸態氮、單糖、單脂類物質，減少多肽類物質量，提升原料分解率[3]。后發酵階段添加乳酸菌、酵母菌，有利于降低醬醪體系的pH，同時抑制雜菌產酸和惡性酵母的生成[4]。本文通過大量試驗，在制曲階段使用米曲霉和黑曲霉菌種聯合發酵制曲，在后發酵階段添加耐鹽酵母菌和乳酸菌，在有效降低醬油二次沉淀生成的同時，能明顯提升原料利用率[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

醬油發酵原料非轉基因大豆、精制小麥粉、食鹽從市場采購；醬油專用M01米曲霉、H02黑曲霉、M21耐鹽高滲透酵母菌、M31耐鹽乳酸菌由廣東美味鮮調味食品有限公司提供；葡萄糖、麥麩從市場采購。

1.2 儀器與設備

冰箱、超凈工作臺、生化培養箱、耐鹽菌擴培系統、種曲機、NK式旋轉蒸煮鍋、拌料絞龍、發酵池、松曲機、自動出曲機、65 m3發酵罐、列管換熱器、熱沉罐和灌裝機等。

1.3 方法

1.3.1 小試驗證米曲霉混合黑曲霉制曲添加比例

（1）利用超靜工作臺、生化培養箱設備，培養M01米曲霉、H02黑曲霉菌種，培養成熟后，放置在冰箱中，供小試使用。

（2）小試制大曲。試驗參數：總用種比例為混合料（黃豆+面粉）的0.04%。黃豆（以干黃豆計）∶面粉按照1∶0.3的比例，M01米曲霉和H02黑曲霉菌種配比分別按照9.5∶0.5、9.0∶1.0、8.5：1.5、8.0∶2.0、7.5∶2.5和7.0∶3.0配比進行試驗，以中性酶活力、酸性酶活力和大曲消化率3項指標的檢測結果作為判斷依據，每個配比平行做5組，取結果平均值作為該組配比的結果。對照樣：以正常大生產M01菌種培養大曲為對照樣。

1.3.2 中試驗證最佳配比制曲效果

根據1.3.1結果，取最優組合作為大曲中大試的試驗參數，開展中大試試驗。試驗參數：總用種比例為混合料（黃豆+面粉）的0.04%，黃豆（以干黃豆計）∶面粉按照1∶0.3比例；試驗量：1.5 t酵池，共投5條池進行驗證；對照樣：以正常大生產M01菌種培養大曲為對照樣。

1.3.3 大試驗證最佳配比制曲效果及醬油的貨架期沉淀

按照1.3.2驗證的最佳配比，以生產規模生產2批次大曲，投入2個60 m3發酵罐中進行后期發酵，驗證大生產階段大曲的質量指標情況及發酵天然油滅菌、過濾后放置6個月內出現的二次沉淀情況。試驗參數：參照中試參數；對照樣：以正常大生產M01菌種培養大曲及發酵天然油為對照樣。

1.3.4 小試添加M21耐鹽高滲透酵母菌、M31耐鹽乳酸菌的最佳量

在曬場后發酵階段，選取1.3.2步驟的試驗大曲制作后發酵醬醪，醬醪鹽水濃度為19°Bé，料水比為1∶2.0。按照正交試驗，分別在第14天添加M31耐鹽乳酸菌和第40天添加M21耐鹽高滲透酵母菌，發酵120 d后，分離出發酵醬油，檢測全氮、氨基酸態氮、濁度指標，經常規滅菌、過濾后灌裝，觀察貨架期6個月內出現沉淀情況，并通過離心收集析出沉淀物的量進行分析，確定最佳添加量。對照樣：以正常大生產M01菌種培養大曲發酵醬醪為對照樣。

1.3.5 中大試驗證添加M21耐鹽高滲透酵母菌和M31耐鹽乳酸菌的效果

在曬場后發酵階段，根據1.3.3小試結果，開展中大試試驗，醬醪鹽水濃度為19.0°Bé，料水比為1∶2.0，發酵周期120 d。發酵結束后檢測發酵醬油的全氮、氨基酸態氮、濁度指標；經滅菌、過濾后灌裝，觀察貨架期出現沉淀情況。對照樣：以正常大生產M01菌種培養大曲發酵醬醪為對照樣。

1.3.6 指標測定方法

中性酶活力、酸性酶活力：SB/T 10317—1999；大曲消化率：Q/MWX 108456—2017；全氮、氨基酸態氮：GB/T 18186—2000；濁度：Q/MWX 108511—2019；沉淀量：每瓶（500 g）樣品，以3 500 r·min-1離心20 min，傾倒液體后，濾紙上倒置1 min后稱量。

2 結果與分析

2.1 小試驗證不同M01米曲霉混合H02黑曲霉配比制曲結果

由表1可知，M01米曲霉與H02黑曲霉配比在9.0∶1.0時，大曲的總酶活力和消化率均最高，其中總酶活力3 106 U，為對照樣的1.10倍；消化率為83.8%，為對照樣的1.04倍。H02比例進一步增加后，大曲中性酶活力會逐漸降低，影響M01菌株性能，造成總酶活力降低。故M01米曲霉∶H02黑曲霉=9.0∶1.0是最合適的，按照該配比進行中大試試驗。

表1 M01米曲霉混合H02黑曲霉不同添加比例制曲結果

2.2 中大試驗證最佳配比制曲效果

由表2可知，5個試驗組總酶活力平均結果為3 037 U，為對照樣的1.1倍，提升10%。消化率為83.7%，為對照樣的1.05倍，提升5%。試驗結果與小試結果基本保持一致。

表2 M01米曲霉混合H02黑曲霉最優組合制曲中大試結果

2.3 大試驗證最佳配比制曲效果及醬油的貨架期沉淀

由表3可知，大試生產的大曲總酶活力3 053 U，為對照樣的112%，消化率為83.6%，為對照樣的1.05倍，結果與中試結果基本保持一致，大曲消化率水平相比于對照組有明顯的提升。

表3 大試生產大曲檢測結果數據

由表4可知，試驗大曲生產的天然油全氮提升1.74%，氨基酸態氮提升3.96%，濁度降低36%，6個月貨架期沉淀降低42.9%。

表4 大試生產天然油結果及滅菌過濾后貨架期二次沉淀量結果數據

2.4 小試M21耐鹽高滲透酵母菌、M31耐鹽乳酸菌最佳添加量結果

由表5可知，在不同添加量酵母菌和乳酸菌的組合試驗中，在14 d添加2‰的M21乳酸菌和第40天添加2‰的M31酵母菌，所得樣品的二次沉淀析出量最少，樣品（500 g）放置6個月后，析出量為0.11 g，為對照樣（0.85 g）的12.9%。同比減少87.1%。該配比為最優配比，按照該配比進行中大試試驗。

表5 不同添加量M31酵母菌和M21乳酸菌組合下的沉淀量

2.5 中大試驗證添加M21耐鹽高滲透酵母菌和M31耐鹽乳酸菌的效果

按照M01米曲霉∶H02黑曲霉=9.0∶1.0制曲后，以醬醪鹽水濃度為19°Bé，料水比為1∶2.0投料，進行曬場環節后發酵，其中分別在第14天加入2‰的M21乳酸菌，第40天加入2‰的M31酵母菌，發酵周期120 d后，以自淋方式放出天然油，檢測并經滅菌、過濾后裝瓶。進行相關指標檢測和觀察，結果如表6所示。

表6 添加M21耐鹽高滲透酵母菌和M31耐鹽乳酸菌生產大試結果

由表6可知，生產大試結果與對照樣相比，天然油全氮提升4.1%，氨基酸態氮提升5.9%，濁度降低60%，6個月貨架期沉淀降低86.9%。試驗結果與小試基本一致。

3 結論

在制曲階段，以M01米曲霉∶H02黑曲霉=9.0∶1.0的比例制曲，能顯著提升大曲酶活力和大曲消化率，制備的大曲在曬地發酵階段，分別在第14天和第40天添加2‰的M21乳酸菌和M31酵母菌，能顯著改善醬醪的發酵環境，促進大分子結構多糖向單糖和單酯轉化，確保天然油體系的穩定性[6]。綜合影響，貨架期沉淀降低86.9%，同時蛋白原料向氨基酸態氮轉化率提升5.9%，效益明顯。在降低醬油貨架期二次沉淀的同時，提升了原料的轉化效率。

米曲霉與黑曲霉聯合發酵，能充分利用米曲霉蛋白酶能力和黑曲霉產淀粉酶的能力，相互促進，增強了酶系的寬度和廣度。將原料中蛋白質和淀粉、糖類物質分解成小分子物質，利于美拉德反應的進行，在發酵階段前期添加乳酸菌物質，能迅速降低醬醪的pH，抑制雜菌的生長和對原料的消耗[7]。發酵第40天時添加酵母菌，能促進體態的后熟，促進大分子結構多糖向單糖和單酯轉化，使體系向著小分子化方向轉化[8]。本研究成果的應用能顯著提升醬油的貨架期質量，提升原料利用率，在節能降耗環保方面，有著明顯的優勢。