基于UPLC-MS/MS的林下三七不同部位生物堿類成分分析

張 澳，嚴星茹，熊冰杰，黃佑國，何 舒，周發(fā)金，王 澍，施 蕊

（西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室/昆明生態(tài)林業(yè)產(chǎn)業(yè)國際科技研發(fā)中心/西南林業(yè)大學園林與園藝學院，云南昆明 650224）

五加科人參屬三七[Panax notoginseng(Burk) F.H.Chen]作為云藥的代表聞名杏林，《本草綱目》譽之“金不換”“補血第一”，即具備散瘀止血、消腫止痛的功效[1]。近年來云南三七產(chǎn)量全國占比高達98%以上，正逐漸形成種植加工銷售一體化的龐大產(chǎn)業(yè)體系[2]。國家中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略提出需要全面提升中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平即實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級[3]，而三七產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級過程發(fā)現(xiàn)了一個嚴重的門檻，三七產(chǎn)品開發(fā)深度和廣度不足導致三七產(chǎn)值低、產(chǎn)業(yè)鏈短[4-6]。因此，為增加三七產(chǎn)值和延長三七產(chǎn)業(yè)鏈，提高三七資源的綜合利用率是十分必要的。

現(xiàn)階段，三七的研究領域主要集中于三七的傳統(tǒng)入藥部位根部及其皂苷類成分[7-8]，有關(guān)三七不同部位和非皂苷類成分的研究較少。三七的果實和葉片作為其生長發(fā)育過程中的伴生產(chǎn)物，常常順應自然凋落腐爛，實際是一種資源浪費。生物堿類成分是植物體內(nèi)的一類次生代謝產(chǎn)物，根據(jù)化學結(jié)構(gòu)可分為吡咯、吡啶、吲哚等十余種[9]，具備豐富的生物活性，王騰飛等研究發(fā)現(xiàn)其具有抗癌、抗病毒、抗炎和抗菌等多種藥理作用，在植物的適應性、抗逆性等方面也發(fā)揮著重要作用[10]。因此，為增加三七資源綜合利用的多樣性，可以從三七不同部位的生物堿類成分入手探尋新思路。

植物代謝組學，是一門采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用等多種手段全面、高通量對植物化合物進行定量、定性分析的新興學科[11]。代謝組學方法正逐漸成為應用在藥用植物的中藥基原鑒別[12]、野生與栽培品的鑒別[13]、藥用部位鑒別[14-15]、不同發(fā)育期的成分鑒定及不同產(chǎn)地藥材的品質(zhì)差異[16]等方面的有效手段。

本實驗采用廣泛靶向代謝組學方法對三七的果實、葉片、根的生物堿類成分進行分析，

通過主成分分析(PCA)結(jié)合正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的方法，篩選三七不同部位的差異化合物，探尋鑒別三七部位的生物堿類標志物，挖掘三七果實、葉片和根部的利用價值，以期為提高三七資源的綜合利用率提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗樣品林下三七采集于瀾滄竹塘（N22.74°，E99.82°，H1 457.39 m），按不同部位分為果實、葉片、根，即三組樣品，每組3 次生物學重復，樣品信息如表1所示。

表1 林下三七樣品信息

儀器：超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜儀（Tandem mass spectrometry，MS/MS）；凍干機（Scientz-100F）；研磨儀（MM 400,Retsch）；離心機；渦旋儀，精密天平。

試劑：甲醇（色譜純，Merck）；乙腈（色譜純，Merck）；標準品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）；純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備和提取

將林下三七完整植株鮮品真空冷凍干燥成干品，然后分揀成果實、葉片、根三部分，分部位放置研磨儀中研磨成粉末（30 Hz，1.5 min），分裝編號成F（果實）、L（葉片）、R（根）備用。精密稱定100 mg粉末浸泡于1.2 mL 的70%甲醇提取液中，使用借助渦旋儀每30 min渦旋1次，每次30 s，共渦旋6次，然后充分混勻后，放置于4 ℃冰箱冷凍過夜。混合液用離心機離心（12 000 r·min-1）10 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾得到濾液，裝入進樣瓶進樣分析。

1.2.2 超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測

液相條件：采用Agilent SB-C18 1.8μm（2.1 mm×100 mm）的色譜柱進行色譜分離；設置柱溫40 ℃，流速0.35 mL·min-1，進樣量4 μL；流動相A 為加入0.1%甲酸的超純水，B相為加入0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：采用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP）進行質(zhì)譜分析，配備ESI Turbo 離子噴霧接口；渦輪噴霧離子源操作參數(shù)設置源溫度550°C，離子噴霧電壓（IS）5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負離子模式），離子源氣體I（GSI）、氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設置為50、60 和25.0 psi，碰撞誘導電離參數(shù)高。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用UPLC-MS/MS 方法獲得質(zhì)譜峰圖，利用Analyst 1.6.3 軟件處理三七樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用MultiaQuant 軟件對質(zhì)譜峰進行積分校正，完成定性定量處理。對通過混合樣本檢測得到的總離子流圖（TIC 圖）進行重疊展示分析，判斷數(shù)據(jù)的重復性、可靠性和儀器的穩(wěn)定性。處理后的數(shù)據(jù)歸一化后采用多元統(tǒng)計分析中的主成分分析方法，對龐大復雜的數(shù)據(jù)進行“簡化和降維”，建立PCA 得分圖，根據(jù)各樣本組間、組內(nèi)的分離趨勢判斷其差異程度。采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）彌補PCA 方法的不足，在原始數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)換后進行中心化處理，利用R 軟件中的MetaboAnalystR 包OPLSR.Anal 函數(shù)進行分析，建立OPLS-DA 正、負模型，得到OPLS-DA 得分圖、OPLS-DA S-plo 圖、VIP（投影中變量重要性）圖和聚類熱圖，使組間區(qū)分最大化，篩選出差異化合物。結(jié)合PCA 分析和OPLS-DA 分析，采用VIP 值和FC值（差異倍數(shù)值）組合的方法判斷三七不同部位之間的差異情況，得到核心差異化合物和明確三七不同部位的開發(fā)利用價值[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物堿類化合物的定性定量分析

本實驗采用三七的三個部位即果實、葉片、根，共選取9個樣品進行代謝組學分析。

通過UPLC-MS/MS 方法檢測所得MRM 化合物檢測多峰圖（見圖1），峰積分校正處理后經(jīng)標準品對照和數(shù)據(jù)庫自查，結(jié)果表明一共檢測到53個生物堿類化合物，經(jīng)含量對比發(fā)現(xiàn)果實、葉片和根的生物堿總含量具有差異性，果實＞葉片＞根。后續(xù)通過多元統(tǒng)計分析方法對53個生物堿類化合物進行具體分析，找出果實、葉片和根的差異化合物。

圖1 MRM化合物檢測多峰圖

2.2 主成分分析

對檢測所得的化合物進行主成分分析，建立PCA得分圖，每個點表示一個樣品，同樣的圖形表示同一組樣品，點與點之間的距離遠近表示分離效果，距離越遠分離效果越好，表示樣品間差異性越大。

如圖2 所示，第一主成分的解釋率為42.51%，第二主成分的解釋率為24.51%，表明兩個主成分能夠基本反映檢測樣的主要特征信息；mix 樣本即質(zhì)控樣本，位于三個部位樣本的中間且組內(nèi)趨于同一點，說明數(shù)據(jù)重復性良好、可靠；F 位于PC1 的負半軸和PC2 的正半軸，L位于PC1的正半軸和PC2的負半軸，R位于PC1 的正半軸和PC2 的正半軸，F(xiàn)、L、R 三者間明顯分離，說明果實、葉片和根之間的生物堿類成分差異明顯。

圖2 PCA-2D得分圖

2.3 OPLS-DA分析

正交偏最小二乘法判別分析方法可以與PCA 方法互補，更全面地計算成分間的相關(guān)性，去除不相關(guān)的差異信息，使組間區(qū)分最大化篩選差異化合物。對三個部位作兩兩對比即FvsR（果實和根對比）、LvsR（葉片和根對比）、FvsL（果實和葉片對比），進行OPLS-DA 分析區(qū)分不同部位的組間差異，結(jié)果再一次論證果實、葉片和根之間的生物堿類成分差異明顯，與PCA 分析所得結(jié)果一致。其中FvsL 差異性比FvsR 和LvsR 較低，加之與傳統(tǒng)藥用部位根作對比更有意義，所以繼而將重點分析FvsR 和LvsR 的差異化合物。

以VIP ≥1，F(xiàn)C（差異倍數(shù)值）≥2 和FC ≤0.5 作為篩選標準明確不同部位間差異顯著的化合物，F(xiàn)vsR篩選得到26 個差異化合物，下調(diào)22 個，上調(diào)4 個；LvsR 篩選得到24 個差異化合物，下調(diào)15 個，上調(diào)9個。如圖3 所示，正值（或空心圓）代表上調(diào)差異表達化合物，負值（或?qū)嵭膱A）代表下調(diào)差異表達化合物，上調(diào)表示該化合物在根中的相對含量較高，下調(diào)表示該化合物在根中的相對含量較低。果實和根對比中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)最明顯的物質(zhì)是乙酰色胺（pmb0131），下調(diào)最明顯的物質(zhì)是油酰單乙醇胺（mws0983）；葉片和根對比中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)最明顯的物質(zhì)是乙酰色胺（pmb0131），下調(diào)最明顯的物質(zhì)是N-甲基煙酰胺（pma6298）。

圖3 VIP值圖和差異倍數(shù)圖（左為FvsR，右為LvsR）

2.4 差異化合物分析

多元統(tǒng)計分析篩選得到FvsR 和LvsR 組間差異明顯，F(xiàn)vsR 的下調(diào)物占比為84.6%，LvsR 的下調(diào)物占比為62.5%，表明果實、葉片的生物堿類成分比根中更多，同時可以作為鑒別部位的一類標志物。下調(diào)表示該化合物在果實或葉片中的相對含量比根高，因此重點關(guān)注下調(diào)化合物，繼而可以發(fā)現(xiàn)不同部位開發(fā)利用價值的多樣性。

對比分析組間差異化合物中下調(diào)明顯的前三個物質(zhì)的相對含量，結(jié)果如表3 和圖4 所示，相對于根而言，3-吲哚丙酸、甲氧基吲哚乙酸和油酰單乙醇胺在果實中相對含量更高，油酰單乙醇胺下調(diào)最明顯，因為其在根中未檢測出；3-羥基吡啶、N-甲基煙酰胺和5-羥基吲哚-3-乙醇在葉片中相對含量更高，3-羥基吡啶和N-甲基煙酰胺在根中未檢測出；同時發(fā)現(xiàn)果實、葉片兩者和根相比，兩組的上調(diào)差異化合物中最明顯的都是乙酰色胺，因為其只在根中檢測出。

圖4 差異分析柱形圖

表3 林下三七不同部位差異化合物統(tǒng)計

有關(guān)報道表明，三七果實和葉片中的3-吲哚丙酸、油酰單乙醇胺、3-羥基吡啶和N-甲基煙酰胺物質(zhì)具有進一步研究的價值，可以應用于保健品、藥品等產(chǎn)品開發(fā)。3-吲哚丙酸是一種強大的抗氧化劑，對治療阿爾茨海默病有一定作用[18]，也是一種腸道微生物群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，是2 型糖尿病（T2D）發(fā)展的潛在生物標志物，可通過保持β 細胞功能來介導其保護作用[19]。油酰單乙醇胺可通過過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)介導的機制調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，可以在肥胖癥治療中發(fā)揮作用[20]。3-羥基吡啶的衍生物是維生素B6的結(jié)構(gòu)類似物，具有抗氧化作用等廣泛的藥理特性[21]。N-甲基煙酰胺是煙酰胺的化合物之一，可通過調(diào)節(jié)ADMA-DDAH 軸改善內(nèi)皮功能障礙并減輕動脈粥樣硬化，也影響血管血栓形成[22]。而對甲氧基吲哚乙酸和5-羥基吲哚-3-乙醇有關(guān)藥理作用的研究甚少，有待發(fā)掘空間大。甲氧基吲哚乙酸可以根據(jù)其化學式C11H11NO3，參考其同分異構(gòu)體的化合物——5-甲氧基吲哚-3-乙酸，是一種褪黑素的代謝產(chǎn)物[23]。5-羥基吲哚-3-乙醇曾在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)，是5-羥色胺的化合物，可以作為一類急性酒精攝入的標志，可以借為參考[24]。根的特有物質(zhì)乙酰色胺也具備利用價值，色胺是一種單胺生物堿，在大腦中的色胺作為神經(jīng)調(diào)節(jié)劑或神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用，在植物中的色胺是影響植物生長和微生物群落代謝途徑的原料，它曾被發(fā)現(xiàn)可能是植物生長調(diào)節(jié)劑吲哚-3-乙酸生物合成途徑中的一種中間產(chǎn)物[25]。

3 討論與結(jié)論

本研究在林下三七的果實、葉片和根中共檢測出53 個生物堿類化合物，從生物堿總含量多少看，果實＞葉片＞根；從成分差異性看，果實和根對比有26個差異化合物，果實中3-吲哚丙酸、甲氧基吲哚乙酸和油酰單乙醇胺的含量較高，葉片和根對比有24個差異化合物，葉片中3-羥基吡啶、N-甲基煙酰胺和5-羥基吲哚-3-乙醇的含量較高；篩選得到果實特有物油酰單乙醇胺，葉片特有物3-羥基吡啶，根特有物乙酰色胺，可以作為鑒別這三個部位的生物堿類差異標志物。

與常用的高效液相色譜、超高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等成分分析方法相比，本研究采用的超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜法是一種更為快速、準確、可靠、直觀的方法，為中藥材成分檢測、質(zhì)量評價、部位鑒別等提供新思路[26]。三七的傳統(tǒng)藥用部位主要是根，本研究發(fā)現(xiàn)三七果實和葉片的生物堿總量高于根，與崔秀明等分析總結(jié)發(fā)現(xiàn)三七不同藥用部位的藥用成分含量具有差異性的結(jié)論一致[27]，這說明三七不同部位的功效也可能不相同，揭示三七的果實和葉片這類地上部分也可能有利用價值。曲正義研究三七果實成分，發(fā)現(xiàn)三七果實成分含有抗腫瘤活性[28]，孫璠和黃積武等分析三七葉片成分，發(fā)現(xiàn)三七葉片成分含有抗炎活性[29]和抗氧化活性[30]，但發(fā)揮功效的具體物質(zhì)及其作用機理尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)果實中含量較高的3-吲哚丙酸和油酰單乙醇胺有抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用，葉片中含量較高的3-羥基吡啶和N-甲基煙酰胺也有抗氧化、保護心血管的作用，結(jié)合前人的研究成果說明三七果實和葉片有巨大的開發(fā)利用潛力。

本研究從林下三七不同部位的生物堿類成分分析入手，旨在發(fā)現(xiàn)提高三七資源綜合利用率的更多可能性，結(jié)果為三七不同部位鑒別提供了新的差異標志物，為三七果實和葉片的科學開發(fā)利用提供參考價值。針對性了解三七的生物堿類成分，能夠為開發(fā)創(chuàng)新產(chǎn)品提供科學依據(jù)，促進三七資源開發(fā)利用多樣性發(fā)展。