高效液相色譜法同時測定五味子中的4種木脂素成分

唐琪 歐陽云 和薛 王輝 鄭濟芳 徐小娜

【摘要】目的：建立高效液相色譜法（HPLC）同時測定五味子中五味子醇甲等4種木脂素成分的含量。方法：采用Sepax C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，甲醇-乙腈-水流動相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量20μL，檢測波長220 nm。結果：五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素分別在0.365～13.194 mg/g、0.388～14.853 mg/g、0.442～16.630 mg/g、0.313～ 11.882 mg/g濃度范圍內呈良好的線性關系，回收率、精密度、穩定性等試驗結果均符合方法學測定要求。12批不同產地五味子的4種木脂素成分含量有差異，RSD為0.76%～3.28%。結論：建立的高效液相色譜法可用于同時分析五味子中的4種木脂素成分。

【關鍵詞】五味子；高效液相色譜法；五味子醇甲；五味子酯甲；五味子甲素；五味子乙素

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.03.034

【基金項目】廣西自然科學基金項目（2020JJA140132）；廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目（2023KY0527）；桂林醫學院人才引進科研項目（20501020028）。

The Simultaneous Determination of Four Lignans in Schisandra Chinensis by HPLC

TANG Qi1，OUYANG yun1，HE Xue1，WANG Hui2，ZHENG Jifang1，XU Xiaona1，3*

（1.SGuilin Medical College〔School of Public Health〕，Guilin 541199，China；2.South China University〔School of Public Health〕，Hengyang 421001，China；3.The Guangxi Key Laboratory of Environmental Exposomics and Entire Lifecycle Health，Guilin 541199，China）

Abstract：Objective：To establish a high performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneous determination Schizandrol A and other three lignans in Schisandra Chinensis. Methods：HPLC separations were carried out on a Sepax C18 column（250 mm×4.6 mm，5μm）by gradient elution using methanol，acetonitrile and water as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min，and the column temperature was 30℃. The injection volume was 20μL and the detection wavelength was 220 nm. Results：The linear relationships of Schizandrol A，Schisantherin A，Schizandrin A and Schizandrin B were good within the ranges of 0.36～13.20，0.39～ 14.86，0.44～16.63，and 0.32～11.88 mg/g，relatively. The results of recovery，precision，stability and so on all met the requirements of methodological determination. The content of the four lignans tested in 12 batches of Schisandra Chinensis samples from different producing areas was different，with the RSD of 0.76%～3.28%. Conclusin：The established method can be applied to determine the four lignans in Schisandra Chinensis simultaneously.

Key words：Schisandra Chinensis；HPLC；SchizandrolA；SchisantherinA；SchizandrinA；Schizandrin B

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實，具有益氣生津、收斂固澀、補腎寧心等功效[1]，屬我國傳統中藥材。現代研究表明，木脂素為五味子主要的生物活性成分，具有保護肝臟、延緩心肌和血管重構、抗炎及免疫調節等廣泛的藥理作用[2]。目前，已從五味子中分離得到約50個木脂素類成分，且不同木脂素單體成分具有不同的功效[3]。其中，五味子醇甲具有明顯的鎮痛[4]、抗驚厥和抗抑郁[5]、鎮靜催眠、抗癌、抗炎、保護肝細胞和抗自由基活性等作用[6]；五味子酯甲具有止咳、鎮靜、抗炎、抗腫瘤作用[7]；五味子甲素對膠質細胞瘤有較好的增殖抑制作用[8]；五味子乙素具有抗氧化、抗炎、護肝、抗腫瘤等功效[10]。2020年版《中華人民共和國藥典》規定以五味子醇甲的含量作為五味子藥材及飲片質量控制的指標，顯然單一指標成分的含量測定不能全面反映藥材的質量狀況。

為提高中藥材的質量標準，確保其療效穩定，本文采用高效液相色譜法（HPLC）對五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等4種木脂素成分同時進行分析。

1實驗材料

1.1儀器和試劑

戴安高效液相色譜儀LC-20A，KQ-3200DF超聲儀清洗器（昆山超聲儀器公司，中國），萬能粉碎機，中沃水務超強型超純水器，遠紅外干燥箱，冰箱，120目篩。

五味子醇甲（批號110857-201412）、五味子酯甲（批號1529-200001）、五味子甲素（批號110764-201714）、五味子乙素（批號110765-201512）均購于湖南省食品藥品檢定所。分析純無水甲醇、分析純無水乙醇、HPLC級甲醇、HPLC級乙腈均購于江蘇漢邦科技有限公司，水為二次去離子水（自制）。

1.2樣品信息

實驗所用五味子藥材均為2019年產，經中南大學湘雅醫院藥學部劉韶教授鑒定為木蘭科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實。樣品信息見表1。

2方法與結果

2.1色譜條件

采用Sepax C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫：30℃；進樣量：20μl；流速：1.0 ml/min；檢測波長：220 nm。流動相：乙腈（A）-水（B）-甲醇（C），梯度洗脫（0～20 min，A 30%，B 40%；20.1～30 min，A 30%→35%，B 40%→35%；30.1～40 min，A 35%→45%，B 35%→25%；40.1～50 min，A 45%，B 25%；50.1～60 min，A45%→30%，B 25%→40%）。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液制備

分別精密稱定四種對照品適量，加甲醇配制成各種標準儲備液：五味子醇甲（0.7400 mg/mL）、五味子酯甲（0.5000 mg/ mL）、五味子甲素（1.4000 mg/mL）、五味子乙素（0.3000 mg/ mL），于4℃冰箱冷藏、備用。臨用前制備成標準應用液。

2.2.2樣品溶液制備

精密稱取五味子粉末0.25 g置于25 mL具塞比色管中，精密加入90 %甲醇4.00 mL，超聲提取3次，每次提取20 min，過濾，合并三次濾液，定容，搖勻，冷藏備用。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性

取混合對照品溶液、供試品溶液及空白溶劑進樣檢測。結果顯示，在樣品及對照品出峰處溶劑無干擾，表明方法的專屬性良好。

2.3.2線性關系

取混合對照品儲備液適量，制備成一系列不同濃度的標準溶液，平行進樣2次，以標準溶液濃度X對峰面積Y進行線性回歸，以信噪比為3倍確定檢測限，色譜圖如圖1（A）所示，結果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素分別在0.365～13.194 mg/g、0.388～14.853 mg/g、0.442～16.630 mg/g、0.313～11.882 mg/g濃度范圍內呈良好的線性關系，r值均在0.9997～0.9999，回歸方程分別為y=96822x-0.5182、y=89233x-0.6938、y=73700x-0.6239和y=124166x-0.8712。表明各對照品在各自濃度范圍內線性良好。

2.3.3精密度

對同一樣品在日內連續進樣6次，得日內精密度，在連續三天內分別測定6次得日間精密度。結果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值小于5.0%，表明方法的精密度良好。

2.3.4穩定性

取同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣，計算。五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面積RSD分別為1.08%、1.12%、1.47%和1.22%，表明該供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.5重復性

取同一樣品，精密稱取5份，按“2.2.2樣品溶液制備”項下方法制備樣品溶液，平行測定，計算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素平均峰面積，所得RSD值均小于2.0%，表明方法重復性良好。

2.3.6回收率

稱取已知含量的五味子藥材細粉6份，分別精密加入等量對照品，按“2.2.2樣品溶液制備”項下方法制備供試品溶液，測定，計算，結果平均回收率為98.31%～99.08%之間，RSD<2.8%，表明方法的準確性良好。

2.4樣品測定

在優化的條件下分析樣品，利用回歸方程計算樣品中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，代表性的色譜圖如圖1（B）所示。樣品分析結果見表2。

3討論

3.1色譜柱選擇

考察了樣品在Phenomenex LUNR C18、Agilent XDB-C8、Sepax C18及依利特Hypersil ODS C18等色譜柱，發現本實驗中Sepax C18分離效果最好。

3.2流動相選擇

試驗了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水等不同系統流動相，發現以甲醇-乙腈-水梯度洗脫時，峰形、分離效果均最佳。

3.3提取溶劑選擇

木脂素屬極性偏大的化學成分。以五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的總提取率為考察指標，分別用甲醇、乙醇及二者不同比例的水溶液進行提取。結果表明，以90%甲醇為提取溶劑時，目標物的總提取率最高，且提出的色素等雜質的含量較少。

3.4提取方法選擇

選定提取溶劑后，考察了超聲提取20 min、30 min、40 min，回流提取30 min、40 min、50 min，以及浸漬法等方法的提取效果。結果表明，超聲提取30 min為最優的提取方法。

3.5檢測波長選擇

采用DAD檢測器對樣品溶液在200～400 nm波長范圍內掃描，采集光譜圖，結果發現各目標物質在220 nm均有較好的吸收，因此選擇220 nm作為最終檢測波長。

本文建立了同時測定五味子中4種木脂素成分的HPLC分析方法。方法專屬性強、重復性好、簡單高效，可為五味子藥材的質量控制提供參考。12個不同產地的五味子藥材中4種木脂素成分的含量的RSD為0.76%～3.28%，總提取率的RSD值為3.70%，表明各藥材所含木脂素成分存在一定差異，這可能與藥材產地的地質、水源及氣候條件有關，更確切的原因以及由不同產地藥材木脂素成分的差異引起的藥理藥效上的不同需要進一步分析研究。

【參考文獻】

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【作者簡介】

唐琪，女，1996年出生，碩士，研究方向為健康相關物質分析。通訊作者：徐小娜，女，1974年出生，副教授，碩士生導師，研究方向為復雜體系多組分成分分離分析。聯系電話：0773-3680605。

（編輯：侯睿琪）