鐵皮石斛共生萌發真菌對其種子萌發的影響

施海芳，董志淵，石 瑤，胡明舉，叢 琨，楊麗英，袁理春，王家金，石亞娜*

（1.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650223；2.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，為中國傳統名貴中藥材，具有滋陰清熱、益胃生津、增強免疫力等多種功效[1]。鐵皮石斛種子正常狀態下細小，沒有胚乳，只有分化不完全的原胚。在自然條件下，種子胚中的營養不足以支持種子的萌發，必須與特定的真菌建立共生關系[2-4]，共生萌發獲得的植株不僅比非共生萌發獲得的植株生長速度快、成活率高，而且抗病性和抗逆性都得到了很大的改善[4]。

蘭科的共生菌類群主要有擔子菌門（Basidiomycota）的蠟殼耳目（Sebacinales）、膠膜菌科（Tulasnellaceae）和角擔菌科（Ceratobasidiaceae）等，目前已有記錄的石斛屬植物的共生真菌大部分是屬膠膜菌類真菌[5]。楊建文等[6]在膠膜菌屬真菌S7對鐵皮石斛種子萌發的影響研究中發現，膠膜菌屬共生真菌不僅能提高鐵皮石斛種子的發芽率，也提高了鐵皮石斛幼苗在移栽后的抗病性和成活率。一般蘭科種子播種后先在暗處或弱光處培養若干天再轉至光下培養，部分蘭科種子在黑暗條件下可以促進種子萌發。有研究顯示大部分蘭科種子在無光照的條件下可以萌發[7]。然而光照條件對鐵皮石斛與共生真菌共生萌發的影響未有研究。鐵皮石斛是中國比較珍貴的物種之一，也是名貴的傳統中藥材，但存在野生繁殖困難，在自然條件下必須與特定的真菌建立共生關系才能萌發的問題。通過對鐵皮石斛種子與膠膜菌屬真菌是否建立共生萌發關系以及共生萌發過程中光照的影響進行研究，進一步驗證共生真菌對鐵皮石斛種子萌發速率的影響，為鐵皮石斛共生培養真菌的材料選擇提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

膠膜菌屬（Tulasnella）真菌分離自經人工授粉培育的鐵皮石斛根部，試驗菌株來自云南省農業科學院藥用植物研究所。鐵皮石斛種子也來自云南省農業科學院藥用植物研究所。

1.2 培養基

共生培養基（Oatmeal agar，OMA）[8]：燕麥 4 g·L-1+瓊脂 8 g·L-1，pH 值 5.6～5.8，滅菌備用。

菌株活化培養基（Potato dextrose agar，PDA）[9]：土豆 200 g·L-1+葡萄糖 20 g·L-1+瓊脂 17 g·L-1，用于共生萌發真菌的增殖培養。

1.3 鐵皮石斛種子懸浮液的制備

將鐵皮石斛種子放入直徑為6 cm的定性濾紙中，置于1%次氯酸鈉溶液中消毒15～20 min，無菌水沖洗3～4次，每次5 min。將消毒完成的鐵皮石斛種子洗脫到EP試管中，根據需求加入無菌水制成一定體積的種子懸浮液。

1.4 接種過程及對照試驗

選取培養皿中長勢較好的真菌，用無菌解剖刀切成面積為1 cm×1 cm的菌塊，置于共生培養基中進行培養。

吸取1 mL種子懸浮液（約100粒左右的種子），均勻地播種在菌塊周圍的共生培養基上進行共生培養，以不接菌處理為對照（CK），每組重復3次。

1.5 培養條件及觀察記錄方式

封口密封后的培養瓶置于人工氣候培養箱中，培養箱的氣候條件分別為光照12 h·d-1和0 h·d-1，光照強度為2000 Lx，恒溫（23±1）℃，RH 65%～70%。播種后每隔10 d觀察并記錄。參照Stewart&Zettler的方法用0～4個階段對種子的萌發和幼苗的生長發育進行分級描述[10]，以培養皿中一半的種子完成每一階段所需要的時間為記錄結果。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛與膠膜菌屬真菌共生萌發

試驗條件下培養皿中一半的共生萌發種子（約50粒左右）完成第1階段所需時間為10 d；培養皿中一半的共生萌發種子（約50粒左右）完成第2階段，即種皮破裂所需時間平均為20 d；培養皿中一半的共生萌發種子（約50粒左右）完成第3階段，即分化出原生分生組織所需時間平均為30 d；培養皿中一半的共生萌發種子（約50粒左右）完成第4階段，即長出第1片葉并繼續生長，進入幼苗發育初期的平均天數為40 d。相較于空白對照，每個階段所需要的時間均減少10 d左右（表1和圖1）。

表1 鐵皮石斛共生萌發結果

圖1 種子共生萌發培養情況

在同樣的試驗條件下，非共生萌發的鐵皮石斛種子在萌發各階段種子顏色較淺，生長勢相對弱；有共生萌發真菌參與的共生萌發的種子各時期與幼苗顏色正常，生長勢相對較強。

2.2 光照對共生萌發的影響

在培養期內，黑暗條件下的鐵皮石斛種子未觀察到萌發跡象。而在共生培養條件下，種子萌發率為83.91%。

3 討論

在自然界中，蘭科種子萌發必須要與適合共生真菌建立一定的共生關系[11]。共生萌發的優勢大于非共生萌發，非共生萌發的幼苗在移栽到野外后也會與共生真菌建立一定的共生性[12-13]。另外，共生萌發形成的球莖和幼苗建立的蘭科種群也比直接播種到野外萌發生長建立的蘭科種群更優越[14]。部分蘭科植物的共生萌發真菌具有專一性，本次試驗以膠膜菌屬的一種真菌（分離自人工授粉的鐵皮石斛根部）為試驗材料，通過試驗發現，其與鐵皮石斛的共生萌發作用效果顯著，關于萌發后的生長狀況，以及萌發階段的專一性需進行深入研究[15]。