鈦種植體表面GO-CG涂層的制備及性能研究

張玉昕,張亮亮,甘抗,朱娟芳

(鄭州大學第一附屬醫院 口腔醫學中心,河南 鄭州 450052)

微生物感染是影響種植體成功的主要因素,早期的微生物定植可能發生在種植體植入的手術過程中或者術后愈合的早期階段[1]。0.5%～3.0%患者的手術切口處或鄰近部位發生感染[2]。這種形成于植入術后愈合早期階段的細菌生物膜會阻止種植體表面上皮組織封閉,導致發生不可逆轉的細菌黏附和增殖,危及骨結合過程,因而早期階段的細菌抑制對于植入的長期成功十分重要[1,3]。晚期的微生物感染則會引發生物學并發癥,出現種植體周圍軟硬組織炎癥并且破壞種植體周圍已經形成的骨結合,使種植體松動甚至脫落。種植體周圍感染性疾病的臨床治療方案尚無定論且治療效果難以預測[4]。因此,研究者希望通過賦予種植體本身抗菌性能,阻止早期微生物的初始附著,盡量阻止晚期微生物定植和感染性生物膜的形成,從而預防種植體周圍感染性疾病的發生,實現種植體長期穩定。本研究擬通過在純鈦種植體表面構建由氧化石墨烯(graphene oxide,GO)負載葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine gluconate,CG)的抗菌活性涂層,實現早期藥物釋放抗菌與接觸抗菌雙重抗菌作用互補的效果。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

鈦片(江蘇珂潤璽醫療科技發展有限公司)、氧化石墨烯水溶液(蘇州碳豐石墨烯科技有限公司)、葡萄糖酸氯己定水溶液(上海麥克林生化科技有限公司)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)(日本HITACHI SU5000)、能譜(energy dispersive spectrum,EDS)分析儀(英國Oxford Instruments Ultim Max)、接觸角測定儀(上海中晨-JC2000C1)、紫外可見分光光度計(日本SHIMADZU CORPORATION)、小鼠胚胎成骨細胞(MC3T3-E1)[賽百慷(上海)生物技術股份有限公司]、DAPI染色液(北京雷根生物技術有限公司)、CCK-8試劑盒[東仁化學科技(上海)有限公司]、Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)、倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)、多功能酶標儀(美國MOLECULAR DEVICES)、金黃色葡萄球菌(BNCC 186335)、大腸桿菌(BNCC 133264)。

1.2 樣本制備

將直徑10 mm、厚2 mm的四級醫用純鈦圓片噴砂酸蝕后得到Ti組樣本。Ti組樣本經超聲蕩洗、干燥后,浸漬于5 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中,60 ℃處理24 h,超純水蕩洗、干燥,50 g·L-1的3-氨丙基三乙氧基硅烷超聲處理2 h后,將樣本在0.2 g·L-1的GO溶液中浸泡24 h,超純水蕩洗、干燥后獲得Ti-GO組樣本。將Ti-GO組樣本平鋪浸泡于1 g·L-1的CG溶液中,4 ℃浸泡24 h,超純水蕩洗、干燥,得到Ti-GO-CG組樣本。各組樣本均雙面輻照滅菌后備用。

1.3 材料表征

對各組樣本(Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組)進行噴金前處理,利用SEM及EDS對樣品表面進行微觀形貌觀察和元素分析。以蒸餾水為介質,通過接觸角測定儀檢測上述3組樣本表面的接觸角并分析材料表面的親水性。

采用透析法[5]觀察Ti-GO-CG組材料表面的藥物釋放情況。將樣本放入密封離心管中,加入10 mL PBS緩沖液,置于37 ℃ 100 r·min-1的恒溫搖床中。使用紫外分光光度計,第1、2、3、5、7天分別采集1 mL浸提液樣本檢測吸光值(optical density,OD),繪制CG累積釋放量曲線。

1.4 體外細胞毒性實驗

樣本浸提液(extracting solution,ES)制作。按照1 mL細胞培養基對應1.25 cm2材料表面積的比例放入密封離心管中,于37 ℃ CO2恒溫細胞培養箱中靜置72 h,得到各組材料的浸提液備用。

配制含100 g·L-1胎牛血清和10 g·L-1雙抗的α-MEM完全培養液,對MC3T3-E1細胞進行傳代培養。選生長對數期的第3～5代細胞進行體外細胞實驗。

使用DAPI染色法檢測各組材料(Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組)表面細胞黏附能力。將3組樣品分別平鋪于24孔板內,每孔接種1×104個細胞,培養24 h,40 g·L-1多聚甲醛固定,DAPI染色,使用倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

使用CCK-8法檢測3組材料浸提液對細胞增殖的影響。設置各組的樣本浸提液為實驗組,記為Ti-es組、Ti-GO-es組和Ti-GO-CG-es組,以培養基為對照組,記為Control組。將細胞接種于96孔板內,每孔2×103個,培養24 h后實驗組各孔更換為對應的材料浸提液,對照組加入細胞培養基,分別于第1、3、5天,吸凈孔內培養基,并加入100 μL配置好的CCK-8工作液,培養箱中避光放置2 h,使用多功能酶標儀測定450 nm 處OD值。

使用Calcein AM/PI試劑盒進行細胞Live/Dead染色實驗。實驗分組同上述CCK-8實驗。將細胞接種于24孔板內,每孔1×104個,培養24 h后實驗組各孔更換為對應的浸提液,對照組使用細胞培養基,分別于第1、3天,吸凈孔內培養基后每孔加入Calcein AM/PI檢測工作液,培養箱中避光孵育30 min。使用倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.5 體外抗菌實驗

挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌單克隆于10 mL液體Luria-Bertani培養基中,37 ℃恒溫搖床內培養過夜,將增菌后的菌液于紫外分光光度計中測定濃度后按梯度稀釋制備成106CFU·mL-1的細菌懸液備用。

使用抑菌環法檢測各組材料(Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組)對細菌的抑制效果。取100 μL濃度為106CFU·mL-1的菌懸液添加到LB固體培養基平板中,涂布均勻后將3組樣品實驗面輕貼于平板表面,培養24 h后觀察并采集圖像。

使用比濁法檢測材料對周圍環境中細菌的抑制效果。設置空白對照組,記為Control組,設置各組材料為實驗組,記為Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組。24孔板中各組均加入1 mL 105CFU·mL-1的菌液,分別共培養24 、48 h后,使用多功能酶標儀在600 nm處測定OD值。

使用平板計數法檢測各組材料(Ti組為對照組,Ti-GO組和Ti-GO-CG組為實驗組)對細菌生物膜形成的抑制效果。樣品置于24孔板內,每孔加入1 mL 105CFU·mL-1的菌懸液,培養48 h。PBS緩沖液輕柔沖洗后,分別將各組樣本置于裝有1 mL PBS緩沖液的離心管中,超聲震蕩3 min,獲得分散的菌液。對此菌液進行逐級稀釋后涂布平板,24 h后進行菌落計數并計算抗菌率。抑菌率為對照組與實驗組的差值占對照組的百分率。

通過SEM觀察各組材料(Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組)表面細菌生物膜的形成情況。24孔板放入3組樣品,每孔加入1 mL濃度為105CFU·mL-1的菌懸液培養48 h至形成生物膜,PBS緩沖液清洗,25 g·L-1戊二醛于4 ℃固定過夜,PBS緩沖液清洗,干燥,噴金,SEM觀察。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 材料表征

2.1.1材料表面微觀形貌和元素分析

Ti組表面布滿噴砂酸蝕后的微小凹陷,Ti-GO組及Ti-GO-CG組樣本表面可見一層均勻的薄膜狀物質覆蓋在基底的凹陷形貌上,且出現堆疊的褶皺(圖1A)。Ti-GO組較Ti組出現Si波峰,且C、O含量增加,Ti含量降低;在GO涂層的基礎上,Ti-GO-CG組出現了CG特征元素Cl的波峰(圖1B)。

A圖為SEM下材料表面微觀形貌;B圖為EDS下元素分析。

2.1.2材料表面接觸角

Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組表面的接觸角分別為118.02°±4.09°、55.67°±0.26°、19.82°±1.67°,差異有統計學意義(F=1 135.325,P<0.001)。兩兩比較,Ti-GO-CG組表面接觸角小于Ti組和Ti-GO組,Ti-GO組小于Ti組,差異有統計學意義(P<0.001)。

2.1.3體外藥物釋放

CG標準溶液在200～400 nm波長范圍內的掃描曲線中測得最大吸收波長為254 nm(圖2A)。以CG標準溶液的濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線(圖2B)。CG水溶液在濃度為50～400 mg·L-1的檢測范圍內,其吸光度值與溶液濃度間為較規律的線性關系,y=0.002 5x+0.175(R2=0.967 8),其中x為CG溶液的濃度,y為吸光度。材料表面的CG在24 h達到了128 μg的累積釋藥量,然后呈現出低劑量的緩慢持續釋放,至第5～7天時釋藥量明顯下降(圖2C)。

A圖為CG掃描曲線;B圖為CG標準曲線;C圖為藥物釋放曲線。

2.2 體外細胞毒性實驗

2.2.1DAPI染色

Ti-GO組和Ti-GO-CG組樣本表面黏附的細胞數明顯多于Ti組。見圖3。

圖3 樣本表面黏附細胞的DAPI染色

2.2.2CCK-8法

各組鈦樣本浸提液細胞培養1、3、5天,OD值均逐漸增加;第1天各組細胞增殖能力差異無統計學意義(P>0.05),第3、5天Ti-GO-CG-es組有抑制細胞增殖的現象,但抑制效果不明顯,與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 CCK-8法檢測細胞毒性

2.2.3Live/Dead染色

第1、3天各組細胞大量存活(綠色熒光),僅觀察到少量死亡細胞(紅色熒光)。見圖5。

A圖為染色后第1天;B圖為染色后第3天。

2.3 體外抗菌實驗

2.3.1抑菌環

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌平板上僅Ti-GO-CG組周圍可見明顯的抑菌環。見圖6。

A圖為金黃色葡萄球菌;B圖為大腸桿菌

2.3.2比濁法

Ti-GO-CG組在24 、48 h均出現細菌增殖抑制,差異有統計學意義(P<0.05),且24、48 h測得的OD值基本不變。而其他3組對菌液中的細菌增殖無抑制效果,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖7。

A圖為金黃色葡萄球菌;B圖為大腸桿菌。

2.3.3平板計數法

Ti-GO組對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率分別為(33.27±4.90)%、(34.98±4.41)%,低于Ti-GO-CG組對金黃色葡萄球菌[(99.05±0.52)%]和大腸桿菌[(95.45±0.25)%]的抗菌率,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖8。

A圖為金黃色葡萄球菌;B圖為大腸桿菌。

2.3.4SEM觀察

Ti組中,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落密集,細菌形態清晰,胞膜完整,分別呈光滑球形和棒狀。Ti-GO組菌落數量明顯減少,細菌和GO膜直接接觸而萎縮死亡(紅色箭頭所示),其他堆積狀態下不直接接觸GO膜的細菌狀態尚可。Ti-GO-CG組表面基本無菌落附著,偶爾可見單個菌落存在,細菌萎縮變形(紅色箭頭所示)。見圖9。

A圖為金黃色葡萄球菌;B圖為大腸桿菌。

3 討論

為制備有良好抗菌活性表面的種植體材料,本研究通過堿熱處理、硅烷化處理和浸漬法在純鈦表面制備GO-CG涂層,并通過涂層材料表征、體外細胞毒性實驗和抗菌實驗對該涂層材料進行了研究,成功制備了鈦種植體表面抗菌涂層。

使用酸蝕和堿處理能夠在材料上制備具有微米、亞微米和納米混合特征的結構表面,并且被證實可改善材料的骨誘導和骨結合效果[6-9]。硅烷偶聯劑廣泛用于含羥基材料表面與生物分子的偶聯[10-11],可以共價連接多肽、蛋白質和聚合物等各種分子。本研究中先將鈦片噴砂酸蝕處理模擬臨床使用,后用堿熱處理的方式使材料表面獲得大量OH。硅烷化處理材料表面,使GO可以通過與3-氨丙基三乙氧基硅烷形成共價鍵在鈦表面實現涂敷,并且獲得的GO涂層能充分嵌入到鈦的多孔結構當中,超聲振動下未產生分離,這樣的嵌入性結構可以降低該涂層在種植體植入時因扭矩而被動脫落的風險。材料表面形成的GO薄膜又可以實現對CG的吸附,使CG完成在材料表面的負載。

本研究通過SEM觀察發現Ti-GO組和Ti-GO-CG組材料表面出現了明顯的均勻薄膜狀物質的覆蓋以及堆疊褶皺,結合EDS結果,Ti-GO-CG材料較Ti組C、O元素含量增加,Ti含量降低且出現CG的特征元素Cl的峰,證明GO負載的CG涂層成功涂敷。水接觸角反映固體表面的表面能。本實驗結果顯示該涂層改善了材料表面的親水性,可以為細胞黏附增殖的良好狀態提供基礎,也說明CG成功負載。體外藥物釋放實驗發現,涂層表面的CG雖然出現了藥物緩釋涂層常見的早期突釋現象,但持續緩慢釋放5～7 d。

表面改性在賦予種植體功能表面的同時產生的細胞毒性不容忽視。特定的情況下石墨烯材料有良好的生物相容性,能夠促進細胞增殖和種植體的骨結合[12]。但是不同種類的石墨烯材料的形態以及大小都對細胞有不同的影響,大部分表現出細胞毒性[13-15]。同樣,CG材料也有著劑量依賴的細胞毒性[16]。只有選擇合適的合成方式、劑量等才能實現生物安全的效果。本研究中制備的鈦表面涂層促進了MC3T3-E1細胞在材料表面的黏附,這與接觸角實驗中親水性的提高的結果相符合,并且本研究的Ti-GO-CG涂層材料浸提液未明顯導致MC3T3-E1細胞的增殖抑制及死亡。

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在手術切口區域的感染中十分常見[2]。金黃色葡萄球菌對鈦有特殊的親和力,是化膿性種植體周圍炎的主要病原菌[17]。GO能夠通過穿透和刺破細菌細胞膜、包裹誘導機械應力、從細菌細胞膜中提取磷脂以及產生氧化應激反應等方式對細菌造成不可逆的損傷[18-22]。CG具有廣譜且高效的抗菌性能,低濃度CG作為一種細胞膜活性成分,引起G+和G-細菌胞內K+和戊糖的外流;高濃度CG通過使蛋白和核酸沉淀導致細菌細胞壁不可逆的損傷[16]。本研究將二者聯合運用后發現, GO-CG涂層具備良好的抗菌效果,具有接觸殺滅和釋放殺滅的雙重抗菌作用。平板計數法和SEM結果顯示,GO涂層對直接接觸的細菌有抗菌作用,但是抗菌率較低。GO-CG涂層在各實驗中均表現出良好的抗菌效果,既可以明顯抑制細菌在材料表面的黏附,抑制材料表面生物膜的形成,且其可以溶解于種植體周圍血液及體液中,使局部CG濃度升高,對周圍環境產生抑菌作用。GO成功負載CG后,抗菌性能得到提升,與單純GO的抗菌作用形成互補,有效抑制細菌生物膜的形成。

4 小結

利用GO負載CG可以在鈦種植體表面成功構建抗菌涂層,制備的Ti-GO-CG涂層材料無細胞毒性,同時具備良好的抗菌性能。本研究仍存在不足之處,由于人體口腔內環境的復雜,種植體材料在植入手術中因扭力造成的磨損,在體內環境中形成的腐蝕,以及該材料對成骨相關過程是否產生影響等問題都有待進一步研究。