PGC-1α/SIRT3信號通路在右美托咪定預處理大鼠脊髓缺血再灌注損傷中的作用及機制研究*

吳江燕 程高升

福建省福州市第一醫院 350009

脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)是指在脊髓缺血所導致的原發性脊髓損傷后,恢復血流再灌注所導致的中樞神經系統損傷,屬于繼發性神經細胞損害和功能障礙,在脊柱損傷、胸腹主動脈瘤、脊髓供血動脈疾患以及主動脈手術后常見,可導致不可逆性脊髓神經元遲發性死亡,嚴重時有潛在致殘、致死性[1]。因此探尋有效減輕SCIRI損傷的方法,對臨床上降低患者術后致殘和致死率具有重要意義。再灌注損傷發生的機制復雜,原因較多,細胞凋亡和炎癥反應是其中較為主要的兩個原因,脊髓缺血導致細胞缺血缺氧,再灌注發生導致細胞內同時出現氧自由基和炎癥反應爆發,鈣超載等病理生理過程,最終加重損傷引起神經細胞凋亡、組織損傷并導致相關功能障礙[2-3]。右美托咪定(DEX)是一種具有高效選擇性的α2-腎上腺素受體激動劑,因其具有鎮靜和鎮痛作用,在臨床麻醉和危重病例的治療中得到廣泛應用。有研究證實,除具有鎮靜、鎮痛效應外,DEX還具有器官保護作用,DEX可以通過SIRT3介導的親環素D(CypD)去乙?；?通過抑制線粒體通透性轉換孔開放,保護線粒體減少損傷,從而減輕大鼠腎缺血再灌注損傷[4]。同時還有研究證實,PGC-1α/SIRT3信號通路與細胞凋亡相關,作為轉錄調節因子,PGC-1α能夠調控線粒體代謝、局部炎癥反應以及機體氧化應激反應,而SIRT3作為PGC-1α信號通路中的下游靶基因,SIRT3激活后能夠改善線粒體自噬和線粒體的合成,減輕氧化應激損傷,抑制細胞凋亡[5-6]。共同提示DEX預處理減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷可能與PGC-1α/SIRT3信號通路相關,但相關研究罕見報道?；诖吮尘?本研究通過觀察DEX是否能夠激活PGC-1α/SIRT3信號通路進而減輕SCIRI,以更加全面深入的探討PGC-1α/SIRT3信號通路是否在DEX預處理減輕SCIRI中具有潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:96只10～11周齡的SD雄性大鼠,SPF環境室溫下自由飲水、標準飼料適應性飼養1周,體重在220～250(236±18)g,四川省實驗動物專委會養殖場飼養。全程依照3R原則給予實驗大鼠人道主義關懷。

1.1.2 主要試劑與儀器:PGC-1α抑制劑SR-18292(MCE中國,生產批號:20180219);鹽酸右美托咪定注射液(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司,生產批號:國藥準字H20090248);細胞TUNEL試劑盒(北京中山生物技術有限公司);細胞裂解液(碧云天生物技術研究所);熒光定量PCR試劑盒、反轉錄試劑盒、Trizol(日本TaKaRa 公司);Western blot 實驗所用抗體(美國CST);蛋白定量試劑盒(自北京威格拉斯生物技術有限公司);透射電子顯微鏡(日本Olympus公司);顯微鑷(型號:15cm,直尖0.15mm)、顯微剪(浙江寧波醫用縫針廠); NikonTi-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司,型號:H-7650);組織包埋機(德國Leica公司,型號:LEICAEG1150)。

1.2 方法

1.2.1 SCIRI大鼠模型構建和分組方式:大鼠麻醉后,常規消毒,右側臥位固定后肋緣行縱切口,逐層分離,于心包處分離胸主動脈,弓鎖骨動脈起始點無創動脈夾夾閉主動脈15min,sham組開胸但不夾閉,0.2ml氨芐青霉素(100mg/L)靜脈注射預防感染。動物模型構建成功后,按照標準飲食進行單獨喂養。分組:sham組、模型組、實驗組以及DPA組,共四組,每組24只。其中:sham組(開胸但未進行夾閉處理,于建模前3h注射與DPA組DEX等量的生理鹽水);模型組(開胸進行夾閉前3h注射與鹽酸右美托咪定等量的生理鹽水);實驗組(于建模前3h鞘內注射與DPA組等量的鹽酸右美托咪定);DPA組(開胸進行夾閉前3h鞘內注射腹腔注射DEX 40μg/kg,同時注射20μmol/L PGC-1α抑制劑SR-18292)。

1.2.2 BBB評分:評估大鼠神經運動功能,分別于再灌注6、8、12和24h時每組隨機抽取6只大鼠,進行改良BBB評分法評分[7],最高分21分,分值越高大鼠后肢功能越好,連續測定3次計算平均值。

1.2.3 脊髓組織病理觀察:24h運動功能評分結束后,每組取6只大鼠,斷頭處死后4%多聚甲醛400ml 將L4～6部位脊髓固定。經常規脫水、透明浸蠟、標記、石蠟包埋、切片(5μm)、HE染色。光學顯微鏡下觀察拍照,計算其正常神經元計數的平均數。

1.2.4 檢測大鼠脊髓組織細胞凋亡情況:再灌注12h完成BBB評分后,隨機處死6只大鼠,取各組大鼠L4～6脊髓節段,固定后常規制備冰凍切片,2次于二甲苯中浸洗,對切片沖洗后,于2%的蛋白激酶K中消化15min,重復沖洗1次,以緩慢滴加TUNEL反應液于其中,37℃避光孵育1h,PBS沖洗液漂洗3次,2min/次,以20%濃度甘油緩沖液封片。于熒光顯微鏡下隨機對每組6個不同視野進行觀察,凋亡細胞百分比=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.2.5 PGC-1α和SIRT3 mRNA表達:Trizol法抽提各組脊髓細胞中RNA,參照逆轉錄試劑盒使用說明合成cDNA,并以cDNA為模板進行擴增。2-ΔΔCt相對定量分析法進行統計分析。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列及擴增產物長度

1.2.6 Western blot檢測PGC-1α和SIRT3蛋白表達量:Western blot在大鼠脊髓組織加入預冷裂解液,研磨裂解脊髓組織,離心獲得上清液。按照BCA試劑盒說明測定總蛋白濃度。取25μg總蛋白上樣,通過10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,分離蛋白轉移至PDVF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2h,加入一抗SIRT3(1∶500)、PGC-1α(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000),在4℃下培育1d,然后將膜與二抗一起培育2h。ECL化學發光試劑盒顯影,采集圖像獲得條帶,以GAPDH進行標定,ImageJ軟件分析目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 四組BBB評分比較 與sham組相比,其余三組再灌注各時點BBB評分均顯著降低(P<0.05);與模型組比較,實驗組和DPA組再灌注各時點BBB評分顯著升高(P<0.05);與實驗組比較,DPA組再灌注各時點BBB評分顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.2 四組大鼠脊髓組織細胞凋亡情況及正常神經元計數 sham 組脊髓神經元結構較其余三組更佳,在光鏡下較為完整,正常運動神經元較多,未見出血、空泡或腫脹,細胞核形態正常,輪廓清楚,呈多極性,細胞漿勻質紅染。模型組脊髓神經元損傷嚴重,正常運動神經元較少,可見空泡形成,較多的神經元壞死,細胞核大量溶解。實驗組與DPA組脊髓神經元結構較模型組稍好,其中實驗組較DPA組稍好。與sham組比較,其余三組AI顯著升高,神經元數量顯著降低,其中模型組AI最高,神經元數最少(P<0.05);與模型組比較,實驗組和DPA組AI顯著降低,神經元數量增加(P<0.05);與實驗組比較,DPA組AI顯著升高,神經元數量顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 四組大鼠脊髓組織細胞凋亡情況及正常神經元計數

2.3 四組大鼠PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質的表達 與sham組比較,模型組和DAP組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質的表達量顯著降低(P<0.05);實驗組PGC-1α和SIRT3 mRNA表達量顯著升高,PGC-1α蛋白質的表達量顯著降低(P<0.05),SIRT3蛋白質的表達量差異不顯著(P>0.05)。與模型組比較,實驗組和DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質的表達量顯著增加(P<0.05);與實驗組比較,DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質的表達量顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 四組大鼠PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質的表達比較

3 討論

SCIRI主要是在大血管術后發生,因其導致的截癱是此類手術后嚴重的并發癥之一,可發展成永久性截癱,嚴重時還可能導致手術患者死亡,然而目前仍無確切有效的防治措施[8]。盡管目前化學因子等輔助治療以及缺血性預處理措施的使用可在很大程度上減少SCIRI的發生,但術后仍然有一定的概率出現SCIRI,導致患者生命安全受到嚴重威脅。因此,進一步探索SCIRI發病機制、開發有效治療方式和特殊治療藥物具有十分重要的意義。早期的研究認為,當SCIRI發生時,缺血區域的神經元表現為神經元壞死病理癥狀,而周圍的神經元表現為遲發性神經元死亡。但當前研究證實,SCIRI引起的神經元壞死的主要原因是細胞凋亡。臨床研究發現[9],DEX除具有麻醉效果好、誘導蘇醒迅速和血流動力學穩定等特點外,DEX預處理還能對包括心臟、肺臟、大腦等許多器官損傷產生保護作用。也有研究表示DEX可通過激活JAK2/STAT3信號通路,抑制凋亡蛋白和炎癥因子表達,減少神經細胞凋亡對SCIRI產生保護作用[10],但是此類研究仍罕見。

在本研究中,筆者通過建立SCIRI大鼠模型觀察了大鼠體內PGC-1α、SIRT3的表達變化,實驗結果顯示,與sham組比較,模型組和DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質的表達量顯著降低;實驗組PGC-1α和SIRT3 mRNA表達量顯著升高,PGC-1α蛋白質的表達量顯著降低。與模型組比較,實驗組和DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質的表達量顯著增加;與實驗組比較,DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質的表達量顯著降低。表明當DPA組加入 PGC-1α 抑制劑后,DEX對大鼠的SCIRI損傷不再起到保護作用,且 PGC-1α和SIRT3的 mRNA及蛋白表達均不再出現顯著升高。此外與sham組相比,其余三組再灌注各時點BBB評分均顯著降低,且sham組>實驗組>DPA組>模型組;其余三組AI顯著升高,神經元數量顯著降低,其中模型組AI最高,神經元數最少;與模型組比較,實驗組和DPA組AI顯著降低,神經元數量增加;與實驗組比較,DPA組AI顯著升高,神經元數量顯著降低。表明隨著PGC-1α和SIRT3的 mRNA及蛋白表達的降低,大鼠的運動神經功能受損越嚴重,脊髓組織的受損情況越嚴重,提示脊髓缺血再灌注損傷的發生與PGC-1α/SIRT3通路存在聯系,而DEX預處理能夠激活PGC-1α/SIRT3信號通路,達到抑制脊髓神經細胞凋亡,改善脊髓組織的受損情況的作用。

脊髓損傷的基礎研究表明[11-12],SCIRI作為原發性脊髓損傷的繼發性傷害,其發生與缺血缺氧、細胞凋亡、細胞自噬、水通道蛋白異常表達、氧化應激、炎癥反應、能量代謝紊亂等有關,在誘發內質網應激(ERS)后致使細胞凋亡,造成患者出現以運動、感覺功能障礙以及急性或遲發性神經功能缺失為主的臨床癥狀。SCIRI可誘導內質網中未折疊蛋白反應的發生,激活ERS,但持續ERS將誘導細胞凋亡出現,最終加重SCIRI[13]。ERS激活造成線粒體損傷,進而激活Caspase-3,誘導神經細胞的凋亡[14]。PGC-1α是最早被鑒定出的過氧化物酶體增殖物激活受體γ的轉錄輔助激活因子,主要在含有豐富線粒體的神經系統、心肌組織、骨骼肌組織等組織表達,在多種與能量代謝有關的基因及轉錄因子具有調控作用[15]。SIRT3是NAD+依賴的組蛋白去乙?；?主要存在于線粒體內,在線粒體呼吸、能量產生、脂肪酸β氧化和抗氧化等方面發揮重要作用,可以通過調節能量代謝及線粒體功能等阻止腦衰老和神經變性[16]。馮剛、張松松等人的實驗證實[17-18],SIRT3是PGC-1α的靶基因,PGC-1α可誘導SIRT3表達,并增加SIRT3的去乙?；富钚?從而調控氧化應激反應在內的線粒體活動,在線粒體生成過程中發揮重要作用。進一步證實了筆者的猜想,即SCIR大鼠在DEX預處理后PGC-1α誘導SIRT3表達增加,在此通路的調控下,在減輕ERS的同時,線粒體損傷減輕,不再激活Caspase-3誘導神經細胞凋亡。

綜上所述,DEX預處理大鼠SCIRI能夠有效激活PGC-1α/SIRT3信號通路,抑制脊髓神經細胞凋亡,促進神經運動功能恢復,改善大鼠脊髓組織的受損情況。