EGFR在膠質瘤中的表達及其與膠質瘤診斷和預后的分析

劉志軒 姜 蕊

湖北省鐘祥市中醫院腦病科 431900

中樞神經系統(CNS)惡性腫瘤是預后最差的癌癥之一,早在1985年,Westermark B等人發現,表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)基因和膠質瘤密切相關[1]。研究表明EGFR促進膠質瘤增長并影響人的生存率[2-4],然而,EGFR對人膠質腫瘤預后的影響卻少有報道,本文利用腫瘤數據庫TCGA 數據庫,結合R語言,驗證EGFR是否在膠質瘤中高表達,并評估其能否對膠質瘤的患者預后產生影響,為后續EGFR相關分子篩選、明星通路的闡明以及膠質瘤和EGFR相關靶點分子的篩選奠定前期基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料的獲取 從癌基因組數據庫(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取 GBMLGG(膠質瘤)項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數據,將 FPKM (fregments per kilobase per million) 格式的RNAseq數據轉換成了TPM (transcripts per million reads) 格式,進而進行log2轉化。根據分子:EGFR[ENSG00000146648],以0%～50% VS 50%～100%進行分組(EGFR低表達組、EGFR高表達組)、利用軟件:R(3.6.3版本)進行統計分析與表格生成[5]。P<0.05表示兩組抑或多組之間的亞組間存在統計學差異。

1.2 EGFR在膠質瘤中的表達情況 調取數據:UCSC XENA (https://xenabrowser.net/datapages/)經Toil流程(Vivian J等,2017)[6]統一處理的TCGA和GTEx的TPM格式的RNAseq數據。提取TCGA的GBMLGG(膠質瘤)和GTEx中對應的正常組織數據,進而分為臨床變量: 膠質瘤組 VS 正常組。接著將數據按照TPM格式的RNAseq數據進行log2轉化方法進行轉化。 在R軟件中利用ggplot2包可視化分子: EGFR[ENSG00000146648] 在兩組中的表達情況。

1.3 ROC曲線分析 利用R(3.6.3版本)中R包: pROC包[1.17.0.1版本](用于分析)、ggplot2包[3.3.3版本] (用于可視化)處理數據。數據:UCSC XENA (https://xenabrowser.net/datapages/)經Toil流程(Vivian J 等,2017)[6]統一處理的TCGA和GTEx的TPM格式的RNAseq數據。提取TCGA的GBMLGG(膠質瘤)和GTEx中對應的正常組織數據,進而分為臨床變量: 膠質瘤組 VS 正常組。以橫坐標為假陽性率(FPR),縱坐標為真陽性率(TPR) 預測分子:EGFR[ENSG00000146648]在鑒定腫瘤中的作用。數據轉化方法為:TPM格式的RNAseq數據進行log2轉化。

1.4 KM生存分析 從癌基因組數據庫(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/ )獲取 GBMLGG(膠質瘤)項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數據,將FPKM格式的RNAseq數據轉換成了TPM格式,進而進行log2轉化。根據分子:EGFR[ENSG00000146648],以0%～50% VS 50%～100%進行分組,然后利用R包:survminer包[0.4.9版本](用于可視化)、survival包[3.2-10版本] (用于生存資料的統計分析),利用軟件:R(3.6.3版本)進行統計分析與可視化。

2 結果

2.1 TCGA數據庫中患者臨床數據特征 從 TCGA數據庫中納入696例患者臨床信息,男398例,女298例,其中男性相對女性EGFR表達增高(P<0.05)。同時我們也發現相對年輕的患者EGFR的表達也存在增高現象(P<0.05);相比較前兩者,EGFR在膠質瘤亞型中表達差異不顯著(P=0.127)。相比較EGFR的低表達,EGFR的高表達增加死亡率(17.5% VS 21.6%),同時降低生存率(32.5%VS 28.4% )。見表1。

表1 高/低表達EGFR組臨床資料對比

2.2 EGFR在膠質瘤中的表達情況 從TCGA數據庫中納入1 157例正常組和689例膠質腫瘤組患者,從統計描述表中可以看到,正常組的中位數(上下四分位數)為2.10(1.59～2.57),膠質瘤組的中位數(上下四分位數)為5.68(4.69～6.57),見表2。正態性檢驗結果顯示,樣本不滿足正態性檢驗(P<0.05), Mann-WhitneyU檢驗(Wilcoxon rank sum test)結果顯示,膠質瘤組高于正常組,兩組的差值中位數為3.573(3.466～3.682),差異具有統計學意義(P<0.001)。

表2 正常組和膠質瘤組EGFR表達情況統計學數據

2.3 EGFR分子診斷膠質瘤的能力 從圖1可見,EGFR在診斷膠質瘤能力方面,變量EGFR在診斷膠質瘤的臨床特異性和敏感度有較高準確性(AUC=0.979,95%CI= 0.971～0.986)。

圖1 EGFR在預測膠質瘤的ROC曲線ROC曲線下的面積值在0.5和1之間。AUC越接近于1,說明診斷效果越好。AUC在 0.5～0.7時有較低準確性,AUC在0.7～0.9時有一定準確性,AUC在0.9以上時有較高準確性

2.4 EGFR在膠質瘤患者預后生存中的能力 經survminer包計算得到各組的中位生存時間,其中EGFR低表達組的中位生存時間為63.8(46.7～95.8)個月;EGFR高表達組的中位生存時間為41.7(32.5～51.2)個月。從統計檢驗表可得:Log-rank檢驗結果提示,不同EGFR表達分組的生存時間分布差異具有統計學意義(P=0.014);Cox回歸結果提示,不同EGFR表達分組的生存時間分布的差異具有統計學意義(P=0.014)。以上結果提示EGFR高表達組預后更差。見圖2。

圖2 EGFR高/低表達在膠質瘤患者預后生存中的KM曲線圖

3 討論

膠質瘤是臨床中常見的原發性CNS惡性腫瘤,為了指導臨床實際運用,臨床上常用世界衛生組織(WHO)分類系統和 Kernoban 分類系統。上述分類系統在評估神經膠質瘤的惡性程度上具有優勢,但是判斷神經膠質瘤患者的預后上存在明顯短板。因此引入分子病理學分級進而指導神經膠質瘤治療具有很強的現實意義。本文基于前期臨床實踐和對腫瘤相關數據的挖掘,肯定了EGFR在膠質瘤中高表達,并且EGFR表達量對膠質瘤患者臨床預后存在顯著影響。

臨床資料表中發現EGFR存在年齡和性別差異,EGFR在男性膠質瘤患者中表達增多,本次試驗的結果和Quinn T Ostrom等人在NEURO-ONCOLOGY雜志上發表了關于在男性膠質瘤患者中高表達的結論一致[7],然而目前對男性患者EGFR的生物來源尚不清楚,最近一篇論文論述了關于男性Y染色中SOX2部位活化,刺激血管生成素樣4蛋白 (ANGPTL4)表達,增加EGFR磷酸化水平,繼而激活磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT和細胞外信號調節激酶(ERK)促進4E-BP1磷酸化進而級聯誘導干細胞增殖的報道[3],綜上雖然臨床資料顯示EGFR具有男性化傾向,但具體生物機制尚待研究。此外,在臨床資料中我們還發現年齡對EGFR的表達存在影響,在資料中可見EGFR表達高峰主要集中在年齡≤60歲的人群中,而年齡>60歲無論EGFR表達高/低均較前者明顯減少,這一結果可能和膠質瘤病情嚴重,患者普遍生存率低有關。另外一項關于膠質瘤的研究報告稱,EGFR水平高低、OS與年齡分組(≥40歲,<40歲)存在相關性[8]。本文結果顯示,低表達與高表達EGFR分組在組織學類型方面無統計學差異(P=0.127),本次臨床基線資料中也發現EGFR表達高低和膠質瘤生存率相關。

表2結果表明EGFR在神經膠質瘤中明顯表達,提示膠質瘤中的某種細胞抑或組織經由某種機制高表達EGFR。有學者系統闡述了膠質母細胞通過活化EGFRv Ⅲ達到EGFR級聯放大的作用,并通過激活RAS/MAPK/ERK、PI3K/AKT、JAK/STAT、phospholipase C(PLC)/PKC等通路進一步刺激腫瘤生長,抵抗化療藥物進而達到腫瘤惡性增殖的目的[2]。同時,該結果和之前臨床基線資料中膠質母細胞中EGFR高表達占比高的結果相一致。

在預測正常組和膠質瘤結局上,圖1 EGFR的ROC曲線下面積為0.979,顯示出良好的預測能力。目前關于EGRF對膠質瘤的生物學預測功能得到極大的關注和試驗認證[9-11]。另外一項研究報道了T1加權動態對比增強MRI可作為EGFRv Ⅲ狀態的無創生物標志物,用于膠質瘤的診斷[12]。圖2展示了EGFR在預測膠質瘤預后的良好效果,結果顯示:EGFR低表達組的中位生存時間為63.8(46.7～95.8)個月,EGFR高表達組的中位生存時間為41.7(32.5～51.2)個月。EGFR高表達明顯縮短患者生存期,提示EGFR能作為膠質瘤的預后因素。

本研究也存在一定的局限性:(1)研究數據來自TCGA數據庫,沒有EGRF相關的臨床或者動物研究驗證;(2)對EGRF相關基因和通路機制未做進一步闡明和揭示。本研究利用生物信息技術對EGFR和膠質瘤相關性進行研究,展示了EGFR對膠質瘤患者具有良好的預測及預后預測功能,為將來EGFR相關制劑運用于臨床,為膠質瘤患者的早診斷,預后評估提供理論線索。