通用多重不對稱PCR聯合基因芯片實現下呼吸道病原菌及耐藥基因快速檢測*

劉俊杰,謝海宇,張艷妮,陳桂柳,何小維,王 羽

1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510641;2.廣州萬孚生物技術股份有限公司,廣東廣州 510670;3.生物島實驗室/廣州再生醫學與健康廣東省實驗室,廣東廣州 510005

下呼吸道感染(LRTI)已經成為全球面臨的重大公共衛生問題。2016年全球約有3.36億例LRTI患者,導致約238萬人死亡,是全球第六大致死原因[1]。由不同病原菌引起的LRTI臨床表現非常相似,單憑臨床癥狀和病理特征難以鑒別,在病原菌沒有得到正確識別的情況下,可能會導致抗菌藥物濫用[2]。同時,耐碳青霉烯酶的革蘭陰性桿菌在全球范圍內廣泛傳播,碳青霉烯類抗菌藥物的不合理使用是導致革蘭陰性桿菌耐藥率上升的重要原因[3]。因此,快速鑒定識別呼吸道感染病原菌及其攜帶的耐藥基因對臨床準確診斷和合理用藥具有重要意義。用于識別呼吸道病原菌的傳統方法包括病原菌分離培養法、涂片鏡檢法、ELISA和免疫熒光法等[4],這些傳統方法均存在檢測周期長、操作復雜、靈敏度低等不容忽視的問題。近年來,分子檢測技術的快速發展在很大程度上彌補了傳統培養和免疫分析方法用于呼吸道病原菌檢測的不足,大大提高了呼吸道病原菌檢測的速度、靈敏度和特異度[5]。然而,受熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測通道的限制,一次檢測不超過5種靶標[6-7],基因芯片結合通用多重不對稱PCR能夠有效解決這一問題。基因芯片技術是依據核酸序列堿基互補配對的原則,將被標記的PCR產物與固定在芯片表面的探針進行分子雜交,然后通過采集雜交信號對標本進行分析,是一種特異性強、靈敏度高的基因分析方法。通用多重不對稱PCR是在特異性引物的5′端連接一段異源通用序列,通過特異性引物介導的第1階段擴增和通用引物介導的第2階段擴增實現對多種靶序列的同步、高靈敏、高特異性擴增,從而較好地解決多重PCR中引物相互干擾、擴增效率差等缺點,提高PCR的反應重數。因此,基因芯片檢測技術與通用多重不對稱PCR技術聯合使用可實現二者優勢互補,通用多重不對稱PCR的擴增作用和基因芯片的多位點雜交技術可以很好地提高檢測通量[8]。本研究建立的基于通用多重不對稱PCR聯合基因芯片技術的LRTI病原菌及耐藥基因檢測方法(下稱本方法)可同步檢測大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌6種常見的下呼吸道病原菌和兩種碳青霉烯酶基因(blaKPC和blaVIM),可在4 h內完成檢測并輸出結果,可有效助力臨床LRTI的快速診斷及干預。

1 材料與方法

1.1標準菌株 選取目標菌株和非目標菌株的標準菌株共14株,用于方法的建立及特異度和靈敏度的評估。肺炎克雷伯菌(ATCC BAA-1902)、大腸埃希菌(ATCC BAA-2452)、金黃色葡萄球菌(ATCC 43300)、肺炎鏈球菌(ATCC 49619)、鮑曼不動桿菌(GDMCC 1.1336)、卡他莫拉菌(ATCC 25238)、弗氏檸檬酸桿菌(GDMCC 1.1337)、陰溝腸桿菌(GDMCC 1.1338)、產酸克雷伯菌(GDMCC 1.1340)、黏質沙雷菌(ATCC 8100)、奇異變形桿菌(ATCC 35659)、表皮葡萄球菌(ATCC 700566)、唾液鏈球菌(ATCC 13419)、流感嗜血桿菌(ATCC 49766)均購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2儀器與試劑 賽默飛ABI7500實時熒光定量PCR(qPCR)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、晶芯LuxScanTM10K微陣列芯片掃描儀(北京博奧晶典生物技術有限公司)、晶芯BioMixerTMⅡ芯片雜交儀(北京博奧晶典生物技術有限公司)、sciFLEXARRAYER S12非接觸式超微量噴點系統(德國Scienion公司)、2×Lyo-Ready qPCR Mix(美國Meridian公司)、核酸提取及純化試劑(廣州達安基因股份有限公司)、環氧硅烷修飾芯片片基(德國Schott公司)、洗液1[1×檸檬酸鈉鹽緩沖液(SSC)+0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)]、洗液2(0.1×SSC+0.1%SDS)、雜交緩沖液(美國Boston BioProducts公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 標準菌株、肺泡灌洗液和痰液均按照達安基因核酸提取及純化試劑說明書進行標本核酸提取。

1.3.2引物探針設計與合成 參考文獻[9-14]設計與合成檢測肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、卡他莫拉菌的特異性引物。根據GenBank中已公布的mt-DNA、blaKPC、blaVIM基因序列,使用Primer premier 5.0軟件分別設計特異性引物,用于第1步PCR擴增。在每對特異性引物的5′端設計一段非同源通用片段。使用Primer premier 5.0軟件根據不對稱PCR產物分別設計捕獲探針和熒光探針,熒光探針5′端使用HEX標記,捕獲探針5′端氨基化修飾并加poly(T4)。引物探針序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。設計的引物目標片段的序列長度為100～300 bp,針對各靶基因設計的探針長度為23 bp左右。

1.3.3芯片制備 使用點樣緩沖液稀釋探針至40 μmol/L的終濃度,混勻加入384孔板中。在室溫和50%相對濕度的條件下利用芯片點樣儀將探針按預設程序在環氧基玻片上進行噴點式點樣,點陣排列見圖1。每個位點的點樣量為670 pL,點樣直徑為100 μm,點樣間距為300 μm。將點樣完畢的芯片置于敞口盒中,在22 ℃、70%相對濕度水化過夜。在封閉液中浸泡5 min,超純水清洗;使用0.1%的SDS溶液以50 r/min搖床清洗5 min,再次用超純水清洗后以1 000 r/min離心干燥,置于室溫避光保存備用。

注:①為質控DNA;②為碳青霉烯酶基因blaKPC;③為碳青霉烯酶基因blaVIM;④為鮑曼不動桿菌;⑤為金黃色葡萄球菌;⑥為肺炎鏈球菌;⑦為大腸埃希菌;⑧為卡他莫拉菌;⑨為肺炎克雷伯菌;為定位探針;為陰性對照。

1.3.4PCR擴增 以DNA為模板,使用特異性引物進行PCR擴增。第1步PCR體系:2×Lyo-Ready qPCR Mix 25 μL,10 μmol/L的上、下游特異性引物各0.5 μL,模板5 μL,補充ddH2O至50 μL。反應程序:94 ℃ 120 s;94 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,10個循環;94 ℃ 5 s,65 ℃ 30 s,12個循環,產物4 ℃保存。第2步PCR體系:2×Lyo-Ready qPCR Mix 25 μL,10 μmol/L的上游通用引物5 μL,10 μmol/L的下游通用引物0.25 μL,模板5 μL(第1步PCR擴增產物),補充ddH2O至50 μL。反應程序:94 ℃ 120 s;94 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,30個循環,產物4 ℃保存。

1.3.5通用不對稱引物濃度比的優化 通用引物的上、下游引物濃度比是影響通用不對稱PCR產物雜交效率的關鍵因素。選擇8種靶標的混合菌液作為標本進行優化,首先固定下游通用引物濃度為50 nmol/L,然后設置不同濃度比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和50∶1)的上、下游引物進行多重不對稱PCR和芯片雜交分析。

1.3.6芯片雜交與信號分析 取30 μL擴增產物、80 μL雜交緩沖液、10 μmol/L的熒光探針各1.6 μL,補充ddH2O至160 μL混合均勻轉移至芯片雜交儀中以55 ℃、10 r/min連續避光雜交70 min。雜交完成后取出芯片,將雜交反應完畢的基因芯片置于玻片架上,分別在洗液1、2中清洗2次,每次1 min,離心甩干。使用晶芯LuxScanTM10K微陣列芯片掃描儀采集熒光信號,設定條件:Cy3綠色熒光通道,Power:50%,PMT:600,分辨率:5 μm。分析每個樣點熒光信號的中值,當某一位點的信號值大于陰性質控探針信號值加3倍標準偏差即判定該位點為陽性,每個靶基因設置的4個重復位點出現≥3個位點為陽性,即可判定該靶標為陽性。按照上述操作,將8種靶標的標本核酸等量混勻作為PCR模板,進行雜交溫度(45、50、55、60 ℃)和雜交時間(30、50、70、90 min)的優化,選擇最佳雜交溫度和雜交時間。

1.3.7靈敏度試驗 將各目標基因的標準模板調整至104copy/mL進行10倍梯度稀釋作為模板,按照最優的反應條件進行擴增和雜交,以驗證本方法的靈敏度。

1.3.8標本檢測 選取實驗室檢測無致病菌污染的肺泡灌洗液為基質,分別與不同目標菌液混合,制備人工模擬標本,利用本方法進行檢測,驗證本方法對多重感染檢測的準確性。同時,收集24份臨床痰液標本使用本方法及分離培養后的VITEK 2 生化鑒定法、單重qPCR進行檢測并鑒定,通過比較3種方法的最終檢測結果,評估臨床應用效果。

2 結 果

2.1不同通用引物濃度比對應的熒光信號值 通用引物的濃度比是影響通用不對稱PCR效率的關鍵因素。利用通用引物不同濃度比的上、下游引物分別進行多重不對稱PCR和芯片雜交分析見表1。當上、下游引物濃度比為20∶1時,雜交信號最強。因此,確定通用多重不對稱PCR上游通用引物的最佳濃度為1 000 nmol/L,下游通用引物的最佳濃度為50 nmol/L。

表1 不同通用引物濃度比對應的熒光信號值(A.U.)

2.2不同芯片雜交溫度對應的熒光信號值 為選擇最佳的標本雜交溫度,將芯片置于45、50、55、60 ℃條件下雜交30 min后進行熒光信號檢測見表2。在相同時間內,55 ℃時雜交信號最強。

表2 不同芯片雜交溫度對應的熒光信號值(A.U.)

2.3不同芯片雜交時間對應的熒光信號值 為選擇最佳的標本雜交時間,將雜交溫度設置為55 ℃,分析雜交30、50、70、90 min的芯片熒光信號強度見表3。熒光信號的整體強度隨雜交時間的延長而增強。在相同溫度下,雜交反應時間為70 min時熒光信號最強。

表3 不同芯片雜交時間對應的熒光信號值(A.U.)

2.4靈敏度 將各目標菌株的標準菌液進行梯度稀釋,按照最優的反應條件進行擴增和雜交見圖2。高濃度菌液的芯片掃描圖均有清晰可見的熒光位點,隨著菌液濃度降低,熒光強度也明顯減弱。最終,本方法檢測大腸埃希菌的靈敏度為104copy/mL,碳青霉烯酶基因blaKPC、碳青霉烯酶基因blaVIM、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的靈敏度均為103copy/mL,金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和卡他莫拉菌的靈敏度均為102copy/mL。

注:A為碳青霉烯酶基因blaKPC;B為碳青霉烯酶基因blaVIM;C為鮑曼不動桿菌;D為金黃色葡萄球菌;E為肺炎鏈球菌;F為大腸埃希菌;G為卡他莫拉菌;H為碳青霉烯酶基因blaKPC+肺炎克雷伯菌;數字1、2、3分別表示濃度為104、103、102 copy/mL。

2.5特異度 標準菌株加入臨床檢測無菌的肺泡灌洗液作為模擬標本,無菌肺泡灌洗液作為陰性標本,在最佳反應條件下分別對其進行檢測,評價本方法的特異度。圖3A～3H目標菌株各靶基因對應的探針位點出現的雜交信號清晰可見,均符合陽性的預期結果。而其他位點均未出現熒光信號,并且以產酸克雷伯菌、黏質沙雷菌、奇異變形桿菌、表皮葡萄球菌、唾液鏈球菌、流感嗜血桿菌為干擾菌的模擬標本的檢測結果與陰性標本檢測結果一致,靶標位置均無熒光信號檢出,見圖3I。

注:A為碳青霉烯酶基因blaKPC;B為碳青霉烯酶基因blaVIM;C為鮑曼不動桿菌;D為金黃色葡萄球菌;E為肺炎鏈球菌;F為大腸埃希菌;G為卡他莫拉菌;H為碳青霉烯酶基因blaKPC+肺炎克雷伯菌;I為陰性標本及干擾菌。

2.6模擬標本檢測結果 將不同菌株組合混勻,模擬多重細菌感染,對模擬標本進行檢測見圖4。模擬標本檢測符合率均可達100%,能特異性檢出對應的靶標,說明本方法具有較好的檢測分辨力。

注:A為碳青霉烯酶基因blaVIM+肺炎鏈球菌+卡他莫拉菌;B為鮑曼不動桿菌+金黃色葡萄球菌+卡他莫拉菌;C為碳青霉烯酶基因blaKPC+鮑曼不動桿菌+金黃色葡萄球菌+卡他莫拉菌+肺炎克雷伯菌;D為鮑曼不動桿菌+肺炎鏈球菌。

2.7臨床痰液標本檢測結果 利用本方法對24份臨床痰液標本進行核酸提取、擴增及芯片雜交,分析雜交信號見表4。本方法檢出單一病原菌感染17份,多病原菌感染7份,攜帶耐藥基因5份,該檢測結果與單重qPCR鑒定結果一致。由于VITEK 2生化鑒定法不能進行碳青霉烯類耐藥基因鑒定,且VITEK 2生化鑒定法需對標本進行分離培養,對于混合感染標本的檢測易受優勢菌株干擾而導致漏檢,故VITEK 2生化鑒定法鑒定出單一病原菌感染22份,多病原菌感染2份,與真實結果存在一定誤差。

表4 臨床痰液標本的檢測結果(n)

3 討 論

多重PCR可以快速、靈敏地同步擴增多個目標片段,已被越來越多地用于病原菌檢測技術研究領域。基因芯片也是一種高通量、快速、準確的分子生物學檢測技術。本方法可以在同一個反應中同時檢測6種下呼吸道常見病原菌和兩種碳青霉烯酶基因。

在致病菌檢測領域,多重PCR和基因芯片的聯合應用已有相關報道,有研究建立了一種基于將多重連接酶檢測反應及通用不對稱PCR與通用基因芯片方法聯合的檢測方法,純培養物的檢測靈敏度為102～103copy/mL[15],與本方法的靈敏度相當。SONG等[16]針對8種碳青霉烯酶基因建立了基于多重PCR和基因芯片的檢測方法,其檢測靈敏度最低為30 copy/μL。基于多重PCR的基因芯片技術使在一個試管中同時檢測多個目的基因成為可能,但通過電泳法根據產物序列大小分離并不能有效鑒定各種片段[17]。相比之下,本方法耗時更短,并且可以在單次反應中設計更多的待檢靶標。

本研究通過多重PCR擴增富集目的基因,并利用通用不對稱PCR擴增大量單鏈目標片段用于DNA雜交,二者結合能夠實現多重PCR和基因芯片的優勢互補,達到較高的靈敏度和特異度。此外,針對每個靶基因設計了特異的熒光探針,在雜交反應中特異性結合在目標片段的5′端。只有當標本中靶基因經兩輪PCR后的擴增產物與固定在芯片表面的捕獲探針和雜交液中的熒光探針同時發生雜交反應時,才能在芯片表面的預設位點檢測到熒光信號,這一雙重特異性設計保證了本方法的準確性。

此外,目標片段的長度是影響雜交效率的重要因素。有研究表明,短片段較長片段目標序列能產生更高的雜交信號[18]。因此,本研究設計的引物目標片段的序列長度為100～300 bp。探針的設計是建立基因芯片檢測方法的關鍵,本研究針對各靶基因設計的探針長度為23 bp左右,且具有相近的DNA熔解溫度,使各靶基因的雜交反應接近最佳反應條件,經過NCBI BLAST驗證,均具有較強的特異性。此外,有研究表明,DNA雜交效率與目標序列上捕獲探針的位置具有關聯,具體表現為目標序列的5′伸出端的長度與雜交信號強度呈負相關[19]。因此,本研究設計的捕獲探針與目標序列的結合區域均靠近5′端,以提高信號強度。

考慮到下呼吸道病原菌種類繁多且細菌耐藥方式并不局限于產碳青霉烯酶,本研究建立的DNA微陣列不能涵蓋所有的病原菌基因。因此,一些致病菌和耐藥基因不在芯片的檢測范圍內。在后期研究中,可以根據臨床需求靈活改變或增加反應體系中的引物和探針序列,將本方法用于其他靶標的檢測。

使用本方法對下呼吸道病原菌進行檢測,在預先制備好基因芯片的情況下,經過核酸提取、PCR擴增、基因芯片分子雜交、芯片掃描等步驟,總檢測時間約為4 h,且具有高靈敏度、高特異度、高準確度的特點,相對于傳統的病原菌檢測方法更高效、準確。本方法也可搭載于廣州萬孚BoxArray全自動多重核酸檢測分析系統上,將核酸提取、擴增、雜交和檢測的所有過程集成于卡盒內部,實現標本進結果出的全自動檢測過程,為臨床診斷提供快速指導,避免藥物濫用[20]。