反復種植失敗患者慢性子宮內膜炎的組織學診斷及治療價值*

房 格,劉 雯,劉菲菲,于瑞梅,王丹丹,趙 雪,韓 婷

山東大學生殖醫學研究中心(山東大學附屬生殖醫院)/生殖內分泌教育部重點實驗室(山東大學)/山東省生殖醫學重點實驗室/山東省生殖健康臨床醫學研究中心/山東省生殖健康技術創新中心/國家輔助生殖與優生工程技術研究中心病理科,山東濟南 250012

女性月經周期中,子宮內膜經歷周期性的形態學和生物學變化,對胚胎著床至關重要。目前,在子宮內膜中發現了許多與不良妊娠結局相關的生物體,這些微生物破壞了子宮內膜乳酸菌群[1]。慢性子宮內膜炎(CE)是一種持續性子宮內膜炎癥反應,引起CE的原因尚不清楚,CE對妊娠結局的影響可能是因為感染持續存在,干擾了子宮內膜菌群平衡并且破壞著床[2]。CE常無癥狀或僅伴有輕微非特異性表現,如疼痛、功能性子宮出血、性交困難、白斑病等,使其診斷具有挑戰性[3]。據文獻報道,15%～50%的女性子宮內膜長期受炎癥反應的影響,引起復發性流產風險和植入失敗風險升高[4]。因此,提供準確、有效的篩選方法是非常必要的。目前,幾種診斷方法已建議用于CE篩查,包括宮腔鏡和組織病理學檢查等常規方法,還有微生物培養及反轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)等[5],其中典型CE組織學表現是由GREENWOOD等[6]發現的以淋巴細胞和漿細胞為主的炎癥浸潤和間質水腫。然而,CE的診斷標準尚無共識,例如有的研究將整個切片中出現1個漿細胞診斷為CE,而有的研究將整個切片中漿細胞數≥5個/10HFP診斷為CE,且不同標本的切片面積差異較大;同時,不同子宮內膜活檢方法及不同病理切片制作和讀取方法也會導致CE診斷率波動較大。采用免疫組織化學CD138細胞特異性標記物已被證實是一種更準確的測試方法[7]。目前,只有少數小型研究評估了組織學篩選,且對于伴有CE的反復種植失敗(RIF)患者,全劑量、全周期使用抗菌藥物是否能提高其胚胎著床率有待進一步證實[8]。此外,年齡、體質量指數(BMI)、月經周期、不孕年限、不孕類型(原發性和繼發性)、移植失敗次數及凍胚移植前的子宮內膜厚度均可能會影響妊娠結局[9]。本研究對進行宮腔鏡檢查并接受子宮內膜活檢的60例RIF患者進行分析,結合蘇木精-伊紅(HE)染色及CD138免疫組織化學染色結果,對CD138陽性并接受抗菌藥物治療的CE患者不同妊娠結局進行分析,闡明RIF患者中CE的發生率及對妊娠的影響,并對抗菌藥物治療的臨床意義進行評估,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2021年1月在山東大學附屬生殖醫院(下稱本院)就診的60例RIF患者作為研究對象,年齡23～41歲,平均(31.4±3.6)歲,均同意并接受本院的體外受精-胚胎移植(IVF-ET)方案,最終將成功妊娠的30例RIF患者作為妊娠組,未妊娠的30例RIF患者作為非妊娠組。所有患者均通過CD138免疫組織化學染色進行CE篩查,其中CD138陽性的CE患者均進行抗菌藥物治療,治療后進行凍胚移植。RIF定義為移植3次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數4～6個或高評分囊胚數3個及以上均未妊娠。排除標準:子宮異常(子宮縱隔,單角子宮等)、黏膜下子宮平滑肌瘤、宮腔粘連、子宮內膜增生、結核、子宮內膜息肉、輸卵管積水、子宮腺肌癥、遺傳性疾病、內分泌疾病和自身免疫性疾病等。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。本研究經本院醫學倫理委員會審核通過(2021-017)。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 Leica ASP200全自動真空組織脫水機、Leica EG1150組織包埋機、Leica Biocut手動輪轉切片機、HE染色儀、Ultra Path全自動免疫組織化學儀、BX-43光學顯微鏡。

1.2.2試劑 4%中性甲醛、二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、助染液、蘇木素染液、分化液、返藍液、伊紅染液、CD138抗體、Ultra DAB染液。

1.3方法

1.3.1CD138陽性計數 于月經周期的增殖期對60例RIF患者進行宮腔鏡檢查獲取子宮內膜標本并進行病理組織學檢查(病理切片HE染色及CD138免疫組織化學)。病理學醫生檢查組織以確定子宮內膜間質區在10個高倍鏡視野(HPF,BX-43光學顯微鏡,HPF直徑=0.55 mm,HPF面積=0.24 mm2)中漿細胞的數量。依據每10個HPF間質區域存在的漿細胞數量設置5個CE診斷標準:(1)漿細胞數≥1個/10HPF時診斷為CE;(2)漿細胞數≥2個/10HPF時診斷為CE;(3)漿細胞數≥3個/10HPF時診斷為CE;(4)漿細胞數≥4個/10HPF時診斷為CE;(5)漿細胞數≥5個/10HPF時診斷為CE。診斷計數漿細胞時只計算子宮內膜間質區的漿細胞個數,宮頸間質組織中的漿細胞不計數。

1.3.2資料收集 包括年齡、BMI、月經周期、不孕年限、不孕類型(原發性和繼發性)、移植失敗次數、CD138陽性率、凍胚移植前的子宮內膜厚度。

1.3.3抗菌藥物治療 所有漿細胞數≥1個/10HPF的患者均接受了抗菌藥物治療,具體方案為口服左氧氟沙星0.5 g+甲硝唑1 g,1次/天,療程14 d。

2 結 果

2.15種診斷標準陽性與陰性臨床妊娠率比較 統計5種診斷標準的陽性與陰性例數,以及陽性與陰性間患者臨床妊娠率差異發現,漿細胞數≥1個/10HPF時診斷為CE。具體見圖1、表1。

表1 5種診斷標準陽性與陰性例數及陽性與陰性間臨床妊娠率比較[%(n/n)]

注:A為HE染色(×100);B為HE染色(×200);C為HE染色(×400);D為CD138免疫組織化學染色(×100),箭頭處為漿細胞;E、F為CD138免疫組織化學染色(×400),箭頭處為漿細胞。

2.23種不同漿細胞數量的RIF患者抗菌藥物治療后臨床妊娠及活產結果比較 60例RIF患者中,36.7%(22/60)的患者發現組織學CE,并接受了抗菌藥物治療,而后成功妊娠14例。3種不同漿細胞數量的RIF患者抗菌藥物治療后的臨床妊娠及活產結果比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3種不同漿細胞數量的RIF患者抗菌藥物治療后臨床妊娠及活產結果比較[n(%)]

2.3兩組一般資料及CD138陽性率比較 兩組年齡和CD138陽性率比較,差異均有統計學意義(P<0.05);兩組BMI、月經周期、不孕類型、不孕年限、移植失敗次數、子宮內膜厚度比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組一般資料及CD138陽性率比較或n(%)或M(P25,P75)]

2.4多因素Logistic回歸分析 將年齡、BMI、月經周期、不孕年限、不孕類型、移植失敗次數、子宮內膜厚度、CD138陽性作為自變量,臨床妊娠率作為因變量進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,年齡和CD138陽性是RIF患者成功妊娠的主要影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析

3 討 論

著床是一個高度復雜的過程,涉及母親和胚胎2個方面,許多與著床相關的因素還未完全了解,其中子宮內膜起重要作用,在卵巢激素作用下,子宮內膜進行周期性變化[10]。CE因癥狀不明顯可能導致漏診,但是越來越多的證據表明,其與流產、足月出生率下降等不良生殖結果有關[11]。CE患病率因調查的患者群體和診斷方法不同而有差異。有研究顯示,CE在人群中的患病率為24.4%～46.0%,不孕女性患CE的比例為40.8%～57.0%,而在RIF患者中CE發生率為14.0%～57.6%[12]。

有臨床研究表明,子宮內膜是持續暴露于生殖道細菌中的,疾病的存在取決于感染因子與子宮內膜微環境間的相互作用[12]。子宮內膜含有多種免疫活性細胞和自然殺傷細胞,其周期依賴性變化可能在植入過程中起關鍵作用。在正常子宮內膜中,只有基底層存在B淋巴細胞,發生CE時大量B淋巴細胞進入子宮內膜的基底層和子宮內膜腺腔內,由于子宮內膜的革蘭陰性菌誘導異常免疫反應,使B淋巴細胞遷移到子宮內膜間質內[14]。診斷CE的“金標準”是在子宮內膜間質區找到漿細胞,典型漿細胞呈高核質比,細胞質嗜堿性,細胞核呈車輻狀,由于一些原因,如子宮內膜間質區漿細胞表現出類似人子宮內膜間質成纖維細胞和單核細胞外觀,此外,分泌期子宮內膜組織學特征,如淺表水腫和間質細胞密度升高,影響了間質區漿細胞的識別,所以不容易通過常規組織染色識別子宮內膜間質區漿細胞。為了克服上述問題,引入了更精確的免疫組織化學法診斷CE。CD138又稱為syndecan-1,是一種跨膜型硫酸肝素蛋白聚糖,經免疫組織化學染色后在診斷者間一致性較高,表明CD138免疫組織化學是檢測CE子宮內膜間質區漿細胞的有效工具[15]。但是目前CD138免疫組織化學染色診斷的標準尚不一致,診斷標準和標本選擇偏差造成CE患病率不同[16]。有研究報道,在月經周期的第6～12天,即子宮內膜增殖期進行子宮內膜活檢,設置CE的診斷標準為漿細胞數≥5個/10 HPF時,CE患病率為14.0%[15]。在一項RIF的回顧性子宮內膜活檢和免疫組織化學CD138研究中,設置診斷標準為每個HPF中至少存在1個漿細胞,CE患病率為30.3%[17]。根據既往文獻報道,本研究重新確定活檢所需要的漿細胞數量,為每10個HPF間質區存在的漿細胞數量設置了5種不同的診斷標準發現,將陽性標準設置為漿細胞數≥1個/10 HPF時,陽性與陰性患者的臨床妊娠率差異有統計學意義(P<0.05)。雖然將陽性標準分別設置為漿細胞數≥2、3、4個/10 HPF時,臨床妊娠率差異仍有統計學意義(P<0.05),但是將陽性標準設定在較低水平,可以使臨床盡可能多地檢出CE,以便及時干預、治療,避免不良妊娠結局的發生。本研究不同漿細胞數量的RIF患者治療后臨床妊娠率和活產率比較,差異無統計學意義(P<0.05),說明子宮內膜間質區漿細胞數量與CE的嚴重程度無關。

在IVF-ET過程中,年齡、月經周期、不孕年限、不孕類型、移植失敗次數、子宮內膜厚度對成功臨床妊娠至關重要。本研究對妊娠組和非妊娠組的上述影響因素及CD138陽性率進行分析,結果顯示,兩組年齡和CD138陽性率比較,差異均有統計學意義(P<0.05),由此說明年齡是主要的影響因素,妊娠組平均年齡小于非妊娠組,與既往研究結論一致[18]。提示隨著年齡增長,卵巢儲備功能呈不可逆性下降。本研究60例RIF患者中,36.7%(22/60)的患者CD138陽性,被診斷為CE并接受抗菌藥物治療,而后成功妊娠14例,明顯高于非妊娠組的8例。雖然抗菌藥物治療對臨床妊娠的影響目前尚存在爭議,但宮腔內感染原的持續存在對子宮內膜環境有潛在有害影響,治療后明顯提高了臨床妊娠率。因CD138陽性治療后未再次進行子宮內膜組織學復查,推測可能部分CE對抗菌藥物治療不敏感,所以未能獲得成功臨床妊娠,但抗菌藥物治療后敏感的婦女臨床妊娠率比不敏感的婦女高,說明CD138陽性接受抗菌藥物治療是有意義的,與LIU等[19]的研究結果相似,該研究發現CD138陽性婦女接受多西環素治療后,妊娠結局可以得到有效改善。有研究報道表明,RIF合并CE的病例經抗菌藥物治療后臨床和持續妊娠率提高,病理性CE即使未經治療,也不會影響臨床試管授精結果[20]。目前,針對CE的抗菌藥物治療尚無統一標準,本研究經抗菌藥物治療后的CE患者臨床妊娠率和活產率均提高,推測抗菌藥物治療有一定意義。

為進一步分析各因素對臨床妊娠的影響,進一步做多因素Logistic回歸分析,結果顯示,年齡和CD138陽性是RIF患者成功妊娠的主要影響因素。因此,RIF患者應及時就醫,積極治療,減少因年齡增長和CE引起的不良妊娠結局。但是組織學檢查也有局限性,比如子宮內膜活檢基于有限的樣本收集,不能顯示整個宮腔和子宮內膜狀態,分析子宮內膜樣本的依賴性,取決于染色的穩定性、觀察者的經驗、樣本收集的月經周期階段等。雖然各研究中CE對生育影響的結果有差異,推測可能是因為不同患者背景和不同研究對象及對CE診斷標準有差異,但更重要的是RIF可能有更復雜和深層的原因。但是部分非CE患者也成功獲得臨床妊娠,說明診斷性宮腔鏡本身和子宮內膜活檢也可能發揮積極作用,宮腔鏡可以物理去除CE病理生理中涉及的細菌生物膜,同時,子宮內膜活檢和隨后恢復過程可以促進子宮內膜中參與胚胎著床的細胞因子和生長因子分泌[21]。

綜上所述,RIF患者中CE發生率較高,在CD138陽性并通過抗菌藥物治療后,再次胚胎移植更容易獲得臨床妊娠。但是本研究為回顧性研究,樣本量相對較小,今后需進行大樣本的前瞻性研究,并且除了應用宮腔鏡檢查和組織學檢查外,還要針對CE進行微生物培養,以及使用RT-PCR選用敏感的抗菌藥物治療,不斷提高RIF患者的臨床妊娠率。