CpG-ODN DSP30聯合IL-2刺激在慢性B淋巴細胞增殖性疾病細胞遺傳學檢測中的臨床價值

賈曉冬,李建偉,毛 翠

1.天津金域醫學檢驗實驗室有限公司細胞遺傳室,天津 300392;2.廣州金域醫學檢驗集團股份有限公司實驗室管理中心,廣東廣州 510005

慢性B淋巴細胞增殖性疾病(B-CLPD)是一組可累及骨髓和外周血的成熟B淋巴細胞克隆增殖性疾病,其中慢性淋巴細胞白血病(CLL)是臨床最為常見的一類B-CLPD。細胞遺傳學分析對B-CLPD的診斷、危險分層、預后判斷及診療方案選擇均具有重要意義,但由于常規細胞遺傳學(CC)獲取的成熟B淋巴細胞有絲分裂指數低,進而導致疾病檢出率低,且熒光原位雜交(FISH)只能檢測特異位點的異常,不能全面分析染色體異常,因此,B-CLPD的診斷與鑒別診斷一直是國內臨床工作的難點[1-2]。有研究發現,未甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)刺激CLL細胞增殖,可明顯提高染色體核型培養成功率和染色體核型異常檢出率[2-5],但未對非CLL的其他B-CLPD進行相關研究。因此,為提高CLL及其他B-CLPD患者的疾病檢出率,本研究進一步探討了CpG-ODN DSP30聯合IL-2作為刺激劑對CLL和非CLL的其他B-CLPD的染色體核型培養成功率和染色體核型異常檢出率的影響,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年6月天津金域醫學檢驗實驗室初診的491例B-CLPD患者作為研究對象,將240例CLL患者作為CLL組,男168例,女72例;中位年齡67歲。將251例非CLL的其他B-CLPD患者作為non-CLL組,男149例,女102例;中位年齡66歲。CLL及非CLL的其他B-CLPD患者診斷符合《血液病診斷及療效標準(第4版)》[6],患者均通過流式細胞術檢測到單克隆成熟B淋巴細胞,根據英國馬斯登皇家醫院免疫標志積分系統[7]進行分類,CLL患者積分為4～5分,非CLL的其他B-CLPD患者積分低于3分,積分為3分時進行FISH 檢測并參考其他相關檢測以排除套細胞淋巴瘤(MCL)等。

1.2儀器與試劑 光學顯微鏡BX41購自奧林巴斯株式會社;二氧化碳培養箱MCO-18AC購自日本松下電器產業株式會社;BSL-2生物安全柜BSC-1500ⅡB2-X購自濟南鑫貝西生物技術有限公司;醫用離心機JW-1048購自安徽嘉文儀器裝備有限公司;數顯恒溫水箱HH-W21-600購自常州澳華儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱DHG-9140A購自上海一恒科學儀器有限公司;Metasystem染色體自動掃描分析系統購自卡爾蔡司光學(中國)有限公司。冰醋酸購自國藥集團化學試劑有限公司;Gibco培養基和胰酶均購自美國賽默飛世爾科技有限公司;CpG-ODN DSP30、IL-2和秋水仙素均購自上海樂辰生物科技有限公司;DSP30堿基序列為TCGTCGCTGTCTCCGCTFCTTCTTGCC;低滲液為0.075 mmol/L氯化鉀溶液,均購自國藥集團化學試劑有限公司;固定液為冰醋酸和甲醇,按照1∶3進行配制,均購自國藥集團化學試劑有限公司;Giemsa染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1染色體培養與制備 采用牛鮑氏計數板對骨髓細胞進行細胞計數,將每例患者標本分為2份,分別為實驗組和對照組,按照1×106/mL細胞密度種入含8 mL Gibco培養液的培養瓶中,同步進行培養。實驗組加入100 μL CpG-ODN DSP30和IL-2刺激劑(濃度為2 μmol/L),對照組不加刺激劑。實驗組和對照組均放入37 ℃、5% CO2培養箱,對照組培養48 h,實驗組培養72 h。完成培養后加入20 μg/mL秋水仙素0.05 mL孵育2 h,收集細胞,進行制片、染色。

1.3.2染色體核型分析 采用Metasystem染色體自動掃描分析系統分析,每份標本分析20個以上染色體處于中期分裂相的培養細胞。核型異常根據文獻[8]進行詳細描述。1個異常克隆需滿足以下條件之一:(1)≥2個細胞有同樣的染色體數目增加或結構重排;(2)≥3個細胞有同樣的染色體數目減少。在CLL中,3個或4個不相關的染色體畸變定義為復雜核型(CK),5個或5個以上的異常(+ 12、+19和其他與預后良好相關的異常除外)定義為高水平復雜核型(high-CK)。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析處理。計數資料以例數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗,當單組n<5時采用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1染色體核型培養成功率和異常檢出率比較 在240例CLL患者和251例非CLL的其他B-CLPD患者中,實驗組染色體核型培養成功率及異常檢出率均明顯高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。進一步分析發現,在采用CpG-ODN DSP30聯合IL-2刺激后,CLL患者與non-CLL患者染色體核型培養成功率及異常檢出率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 實驗組和對照組CLL和non-CLL患者染色體核型培養成功率和異常檢出率比較[%(n/n)]

2.2CLL組和non-CLL組采用CpG-ODN DSP30聯合IL-2刺激后染色體核型異常檢出情況比較 進一步比較CLL組和non-CLL組采用CpG-ODN DSP30聯合IL-2刺激后染色體核型異常檢出情況,包括染色體數目異常和結構異常。結果顯示,non-CLL組high-CK及CK比例均明顯高于CLL組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。CLL組常見的染色體核型異常由高至低依次為+12、13q-、abn(17p)、14q32(IGH)重排、11q-、6q-等,而non-CLL組常見的染色體核型異常由高至低依次為IGH重排、6q-、+12、7q-、13q-、abn(17p)、+3、+18等。與CLL組比較,non-CLL組更易出現IGH重排、6q-、7q-、+3及+18,見圖2。

圖2 CLL組和non-CLL組常見的染色體核型異常檢出情況比較

表2 CLL組和non-CLL組使用CpG-ODN DSP30聯合IL-2刺激后染色體核型異常檢出率比較[%(n/n)]

3 討 論

B-CLPD的細胞遺傳學異常對于判斷疾病進展、評價臨床預后及制訂治療方案等均具有重要臨床意義。細胞遺傳學分析是檢測細胞遺傳學異常的常用方法,但由于成熟B淋巴細胞屬于終末分化期B細胞,增殖分化能力差,大多數處于分裂間期,常規培養不易獲得中期分裂相。目前,已有研究探討了各類刺激劑對提高常規培養中B淋巴細胞中期分裂相獲得率的不同影響,包括脂多糖、美洲商陸有絲分裂原及植物血凝素(PHA)等,但這些刺激劑對染色體核型異常檢出率的提升效果不佳[8-10]。因此,尋找合適的刺激劑對提升染色體核型培養成功率及異常檢出率均具有重要臨床意義。

現有研究表明,人工合成的CpG-ODN DSP30能夠直接激活B淋巴細胞,提高其增殖能力和細胞因子的分泌速率[9-10]。有研究發現,IL-2具有抗凋亡作用,可促進成熟B淋巴細胞增殖、分化,從而提高中期細胞培養成功率[11]。因此,CpG-ODN DSP30聯合IL-2可以刺激成熟B淋巴細胞有絲分裂,從而可以提高B淋巴細胞染色體核型培養成功率及異常檢出率。多項研究發現,CpG-ODN聯合IL-2共同刺激B淋巴細胞可將染色體核型異常檢出率提高至64%～83%[4-5,10-13]。王冬梅[14]等應用CpG-ODN DSP30及IL-2刺激對115例CLL患者的骨髓標本培養后進行R顯帶分析,其染色體核型培養成功率為74.8%,異常檢出率為58.1%。買地娜·艾爾肯等[15]應用PHA、CpG-ODN DSP30聯合IL-2刺激劑對82例CLL患者的骨髓標本進行培養制片,其染色體核型培養成功率分別為90.2%和68.3%,異常檢出率分別為13.5%和46.4%。有研究發現,CpG-ODN DSP30和IL-2聯合刺激對于CLL的細胞遺傳學分析效果極佳,但對于非CLL的其他B-CLPD研究仍涉及較少[10-13]。本研究進一步探討在CLL及非CLL的其他B-CLPD的細胞遺傳學分析診斷中使用CpG-ODN DSP30聯合IL-2刺激對疾病染色體核型檢測的影響發現,CLL和非CLL的其他B-CLPD患者骨髓細胞經CpG-ODN DSP30和IL-2聯合刺激培養的染色體核型培養成功率分別為98.33%和97.61%,異常檢出率分別為53.39%和59.18%。本研究與國內之前報道比較,新增了對非CLL的其他B-CLPD的對照研究,且增加了病例數,染色體核型培養成功率及異常檢出率均明顯提高,染色體核型培養成功率接近或高于部分國外數據,但異常檢出率相比國外數據稍低,考慮是因為種族差異及地域差異因素影響[10-13]。

B-CLPD是一組異質性很強的疾病,已有研究表明,染色體核型分析對B-CLPD患者診斷、準確危險分層、評估預后及制訂治療方案等方面均具有重要臨床意義[9]。本研究發現,CLL組常見的染色體核型異常為+12、13q-、abn(17p)、IGH重排、11q-、6q-等;non-CLL組常見的染色體核型異常為IGH重排、6q-、+12、7q-、13q-、abn(17p)、+3、+18。既往有文獻報道,+12是CLL中最頻繁的染色體畸變[16],與本研究結果一致,常與不典型CLL細胞形態和免疫表型有關,但出現+12的CLL患者生存期與正常核型患者無差異。單純13q缺失預后較好,生存期長,不需要過多治療[17]。abn(17p)往往提示存在p53基因缺失,在疾病復發或惡性進展時其水平較高,疾病進展較快,患者預后差,生存期短[15]。本研究發現,CLL組檢出CK患者占9.52%,high-CK占12.70%,而non-CLL組檢出CK占21.38%,high-CK占33.79%。既往研究發現,CK與CLL患者不良預后相關,特別是high-CK與CLL中不良預后和對治療(包括新藥物)的不良反應有關[18]。而在B-CLPD患者中,多由特定和常見的染色體易位來解除對已知致癌基因的控制,如濾泡性淋巴瘤的t(14;18)(q32;q21)(涉及IGH::BCL2融合基因),伯基特淋巴瘤的t(8;14)(q24;q32)(涉及IGH::MYC),以及MCL的t(11;14)(q13;q32)(涉及IGH::CCND1融合基因),平衡易位在CLL中很少見[19]。

綜上所述,CpG-ODN DSP30聯合IL2刺激可成為成熟B淋巴細胞染色體培養的首選刺激劑,可明顯提高B-CLPD的染色體核型培養成功率及異常檢出率,有助于更加全面地檢出B-CLPD的遺傳學異常,并且在非CLL的B-CLPD患者細胞遺傳學檢測中同樣具有重要價值。與CLL患者比較,非CLL的B-CLPD患者更易出現復雜核型,預后更差,應進一步加強對B-CLPD遺傳學復雜性及多樣性的認識。