豆科3種植物的抗氧化活性比較

劉滿軍,魏 陽,王曉萍,石會麗,陳 昊,高 蓉,來元如,杜 君

陜西省中醫醫院,西安 710018

課題組在既往的研究中比較了苦刺花、山豆根、苦參中總黃酮成分的含量,建立了3味藥材總黃酮高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)特征指紋圖譜[1]。三者為同科屬藥用植物,均具有清熱燥濕、解毒涼血、利濕消腫等功效,均含有苦參堿、槐果堿、槐定堿等化合物,屬于雙稠哌啶類,具有喹喏里西啶的基本結構,有較強的生物活性[2-5]。此外,3味藥材中還含有黃酮類化合物。有報道苦參、山豆根提取的黃酮類化合物具有抗氧化活性及抑菌活性[6-7],關于二者所含生物堿及苦刺花抗氧化活性的研究目前鮮見報道。目前,普遍認為,自由基及由其誘導的氧化反應是衰老與各種疾病發生的主要原因之一[8-10]。所以天然抗氧化劑的開發和利用是研究的熱點。本文根據3種植物中所含化學成分的性質,用系統溶劑提取法提取主要化學成分,用現行的3種體外抗氧化實驗方法即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABST)法、3-氧代-2苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1氧(PTIO)法分別對三者不同提取部位進行了抗氧化活性研究,為其開發應用及其相互替代提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-250 DE型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);QUINTIX65-1 CN電子分析天平(d=0.01 mg;BSA224 S,d=0.1 mg,北京賽多利斯天平有限公司);移液槍(型號為2～20、10～100、20～200、100～1 000 μL,北京大龍興創實驗儀器股份公司);UV-1700PC型紫外可見分光光度計(上海鳳凰光學科儀有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司);LRH-70/MJ-80-1培養箱(上海一恒科學儀器有限公司);RE-2000 B型旋轉薄膜蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(批號A800764)、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(批號C129138)、3-氧代-2苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1氧(批號p838429),質量分數均≥98%,均購自上海麥克林生化科技有限公司;水為新鮮蒸餾水(自制);其余試劑均為分析純。

苦刺花(批號20210410)為豆科植物白刺花SophoraviciifoliaHance的根,自采于宜君縣;山豆根(批號20211001)為豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根和根莖,苦參(批號20210901)為豆科植物苦參SophoraflavescensAit.的干燥根,均購自陜西興盛德藥業有限責任公司。由石會麗研究員鑒定。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

分別取苦刺花、苦參和山豆根粉末(過40目篩)約50 g,精密稱定,分別置于3個圓底燒瓶中,加入5 mL氨水、500 mL二氯甲烷回流1.5 h,同法處理2次,濾過,減壓濃縮、干燥,得二氯甲烷提取物,備用;藥渣揮干溶劑,加甲醇500 mL,同法回流處理2次,得甲醇提取物;提取物揮去溶劑,分別用無水乙醇溶解,超聲(功率為250 W,頻率為40 kHz)處理20 min,放冷,定容至所需質量濃度。將各部位的提取物名稱簡稱為苦刺花(METH)、苦刺花(CH2Cl2)、苦參(METH)、苦參(CH2Cl2)、山豆根(METH)、山豆根(CH2Cl2)。

2.2 DPPH 法的建立

2.2.1制備DPPH乙醇溶液 精密稱取DPPH 4.46 mg,置于100 mL棕色量瓶中,加無水乙醇溶解并稀釋至刻度,超聲5 min,充分混勻,避光放置,即得0.113 mmoL·L-1的DPPH乙醇溶液。取上述溶液,加適量無水乙醇稀釋后,使其吸光度在0.6～1.0,即得DPPH工作液。

2.2.2預實驗確定供試品溶液最適質量濃度 精密移取DPPH工作液2 mL,置于具塞試管中,加入少量的樣品液。加樣時,由少到多漸加,且邊加邊混勻,觀察溶液顏色的變化,當溶液顏色基本褪去時,記錄樣品加樣量。如果反應緩慢,可在37 ℃培養箱中放置0.5 h,等待完全反應。此加樣量為樣品的最大用量,在此最大用量的基礎上,往前設置至少5個質量濃度,使之盡可能呈等差數列。如預實驗中苦參(METH)的質量濃度為25 mg·mL-1、用量為1 mL時,DPPH溶液的顏色基本褪去,則1 mL為該供試品溶液的最大用量。對該樣品而言,其質量濃度梯度宜設為5、10、15、20、25 mg·mL-1。分別通過預實驗得出最大用量為1 mL時該供試品溶液的最大質量濃度,結果顯示,苦參(CH2Cl2)為20 mg·mL-1,苦刺花(METH)為25 mg·mL-1,苦刺花(CH2Cl2)為80 mg·mL-1,山豆根(METH)為20 mg·mL-1,山豆根(CH2Cl2)為20 mg·mL-1。

2.2.3測定DPPH自由基清除率 按照2.1項下方法分別制備苦刺花、苦參和山豆根的供試品儲備液,稀釋成預實驗所需最大質量濃度的供試品溶液,按照2.2.2項下梯度法,此法參考文獻[11-13]稍作修改。分別取此溶液不同體積置于試管中,用無水乙醇補充每管供試品溶液至1 mL,混合均勻,制得系列質量濃度的溶液,再分別加入同一DPPH工作液2 mL,在適宜反應時間內使反應達到動態平衡后,在517 nm處測定吸光度值,記為Ai,同時,以1 mL無水乙醇與2 mL DPPH工作液的混合溶液作為對照組,其吸光度值記為A0;以相對應的供試品梯度溶液加2 mL無水乙醇作為空白組,其吸光度值記為Aj,按 DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj) /A0]×100%,計算清除率。以質量濃度(mg·mL-1) 為橫坐標、清除率(%)為縱坐標,繪制清除率曲線,計算半數清除率(IC50)。最終每測1個用量需要測定3個平行數據。實驗結果見表1、圖1。

注:A.苦刺花(METH);B.苦刺花(CH2Cl2);C.苦參(METH);D.苦參(CH2CL2);E.山豆根(METH);F.山豆根(CH2Cl2)。

表1 3種不同植物不同提取部位對3種不同自由基清除率IC50值

2.2.4確定反應完成時間 分別移取低、中、高3種質量濃度的供試品溶液,按照2.2.3 項下方法,在反應時間分別為8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 min時測定吸光度值(Ai),觀察各質量濃度下Ai的變化情況。結果顯示,當反應時間為32 min時,其Ai與相鄰時間點(28、36 min)Ai的相對偏差(RSD)均小于5%,表明30 min能使反應達到動態平衡,故確定反應時間為30 min。

2.3 ABTS法的建立

2.3.1ABTS自由基工作溶液的配制 ABST二銨鹽7.4 mmoL·L-1儲備液:取ABST二銨鹽6 mg,加蒸餾水1.47 mL,即得。

過二硫酸鉀(K2S2O8)2.6 mmoL·L-1儲備液:取K2S2O81 mg,加蒸餾水1.43 mL,即得。

ABTS自由基儲備液:分別移取7.4 mmoL·L-1的ABTS溶液1 mL和2.6 mmoL·L-1的過二硫酸鉀溶液1 mL,混合均勻,于黑暗環境下放置12～16 h,即得。

ABTS自由基工作液:實驗前,移取ABTS自由基儲備液2.0 mL,用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液將混合液稀釋10～20倍至吸光度值為0.70～0.90左右,即得。

2.3.2預實驗確定供試品溶液最適質量濃度 精密移取ABST溶液2 mL,置于具塞試管中,加入供試品溶液。加樣時,由少到多漸加,且邊加邊搖,混合均勻,并觀察溶液顏色的變化,當溶液顏色基本褪去時,記錄樣品質量濃度及加樣量。如果反應緩慢,可在37 ℃培養箱中放置0.5 h,等待完全反應。此加樣量即為樣品的的最大用量,在此最大用量的基礎上,往前設置至少5個質量濃度,使之呈等差數列。如預測苦刺花(CH2Cl2)質量濃度最大為1.0 mg·mL-1,則將其質量濃度設置為0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0 mg·mL-1;苦刺花(METH)最大質量濃度為0.20 mg·mL-1、苦參(METH)最大質量濃度為1.0 mg·mL-1、苦參(CH2Cl2)最大質量濃度為1.0 mg·mL-1、山豆根(METH)最大質量濃度為0.60 mg·mL-1、山豆根(CH2Cl2)最大質量濃度為0.20 mg·mL-1。

2.3.3ABTS自由基清除率測定 按照2.1項下方法分別制備苦刺花、苦參和山豆根的供試品儲備液,依據2.3.2項下預實驗結果,配制成最大質量濃度供試品溶液,將設置的等差系列質量濃度稀釋成預實驗所需質量濃度的供試品溶液。此法依據文獻[14-16]稍作修改。分別取此溶液不同體積置于試管中,用無水乙醇補充每管供試品溶液體積至1 mL,混合均勻,再分別加入同一ABTS工作溶液,在適宜反應時間內使反應達到動態平衡后,在734 nm處測定吸光度值(Ai)。同時,以1 mL的無水乙醇與2 mL ABTS自由基工作液作為對照組,測定吸光度值(A0);將相應質量濃度的供試品溶液用無水乙醇稀釋至1 mL,與2 mL pH7.4的磷酸鹽緩沖液混合,作為空白組,吸光度值記為Aj,按 ABTS自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%計算清除率,以質量濃度(mg·mL-1)為橫坐標、清除率(%) 為縱坐標,繪制清除率曲線,進而獲得半數清除率(IC50)。按照2.2.3項下方法測量。實驗結果分別見圖2、表1。

注:A.苦刺花(METH);B.苦刺花(CH2Cl2);C.苦參(METH);D.苦參(CH2Cl2);E.山豆根(METH);F.山豆根(CH2Cl2)。

2.3.4反應時間的確定 分別移取低、中、高3種質量濃度的供試品溶液,按照2.3.2項下方法,在反應時間分別為 5、10、15、20、25、30、35、40 min 時測定吸光度值(Ai),觀察各質量濃度溶液Ai的變化情況。結果顯示,當反應時間為25 min 時,其Ai與相鄰時間點(20、30 min)Ai的RSD值均小于5%,表明25 min能使反應達到動態平衡,故確定反應時間為25 min。

2.4 PTIO法的建立

2.4.1PTIO工作液的制備 取15 mg PTIO,精密稱定,置于100 mL棕色量瓶中,用乙醇溶解并稀釋至刻度,超聲5 min,充分混勻,避光放置,即得0.64 mmol·L-1的PTIO乙醇溶液。取上述溶液,加適量乙醇稀釋后,在587 nm處測定,使其吸光度值為0.6左右。即得PTIO工作液,臨用前現配。

2.4.2預實驗確定供試品溶液最適質量濃度 精密移取PTIO工作液2 mL,置于具塞試管中,向其中加入少量的樣品液。加樣時,由少到多漸加,且邊加邊混勻,并觀察溶液顏色的變化,當溶液顏色基本褪去時,記錄樣品質量濃度及加樣量。如果反應緩慢,可在37 ℃培養箱中放置0.5～2 h,等待完全反應。此加樣量即為樣品的的最大用量,在此最大用量的基礎上,往前設置至少5個質量濃度,使之呈等差數列。如預測苦參(METH)質量濃度為200 mg·mL-1時,用量為1 mL,PTIO溶液的顏色基本褪去,則1 mL為該樣品液的最大用量。對該樣品而言,其梯度質量濃度宜設為40、80、120、160、200 mg·mL-1。苦參(CH2Cl2)質量濃度為200 mg·mL-1、苦刺花(METH)質量濃度為100 mg·mL-1、苦刺花(CH2Cl2)質量濃度為360 mg·mL-1,山豆根(METH)質量濃度為200 mg·mL-1、山豆根(CH2Cl2)質量濃度為100 mg·mL-1。

2.4.3測定PTIO自由基清除率 按照2.1項下方法分別制備苦刺花、苦參和山豆根的供試品儲備液,稀釋成預實驗所需質量濃度的供試品溶液。此法依據文獻[17-18]稍作修改。分別取此溶液不同體積置于試管中,用無水乙醇補充至每管供試品溶液至1 mL,混合均勻,再分別加入同一 PTIO工作液,此反應較為緩慢,在37 ℃恒溫培養箱中放置1 h,等待完全反應。在適宜反應時間內使反應達到動態平衡后,在587 nm處測定吸光度值,記為Ai。同時,以1 mL無水乙醇與2 mL PTIO工作液的混合溶液作為對照組,其吸光度值記為A0;以相應的供試品溶液加無水乙醇至1 mL與2 mL無水乙醇作為空白組,其吸光度值記為Aj,按DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%計算清除率,以質量濃度(mg·mL-1) 為橫坐標、清除率(%)為縱坐標,繪制清除率曲線,計算IC50。最終測定同2.2.3項下方法。實驗結果分別見表1、圖3。

注:A.苦刺花(METH);B.苦刺花(CH2Cl2);C.苦參(METH ;D.苦參(CH2Cl2);E.山豆根(METH);F.山豆根(CH2Cl2)。

2.4.4確定最佳反應時間 分別移取低、中、高3種質量濃度的供試品溶液,按照2.4.2項下方法,置于37 ℃恒溫培養箱中,于反應時間分別為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 min時測定吸光度值(Ai),觀察各質量濃度溶液Ai的變化情況。結果顯示,當反應時間為60 min時,其Ai與相鄰時間點(65、55 min )Ai的RSD值均小于5.0%,表明60 min能使反應達到動態平衡,故確定反應時間為60 min。

2.5 抗氧化活性比較

本研究用3種不同的體外抗氧化活性評價方法考察3種同科屬植物的不同溶劑提取部位的抗氧化活性變化情況。由圖1至圖3知,樣品的抗氧化活性呈不同程度的量效相關性,三者具有相似的特點,對DPPH、ABTS、PTIO自由基的清除率隨樣品溶液質量濃度的增大而增大,計算三者對DPPH、ABTS、PTIO自由基的清除率IC50值,見表1。

由表1可知,自由基清除率IC50值由小到大排列順序依次為:DPPH法為山豆根(CH2Cl2)<山豆根(METH)<苦刺花(METH)<苦參(CH2Cl2)<苦參(METH)<苦刺花(CH2Cl2);ABST法為苦刺花(METH)<山豆根(CH2Cl2)<山豆根(METH)<苦參(METH)<苦參(CH2Cl2)<苦刺花(CH2Cl2);PTIO法為苦刺花(METH)<山豆根(CH2Cl2)<山豆根(METH)<苦參(CH2Cl2)<苦參(METH)<苦刺花(CH2Cl2);其抗氧化活性由大到小排列順序同上。自由基清除率IC50值越小,其抗氧化性越強。3種方法的測定結果基本相似,表明測定結果具有較高的可信度。

3 討論

3.1 量效、構效關系

本研究分別以DPPH、ABST、PTIO自由基清除率為指標,測定了山豆根、苦刺花、苦參不同提取物的抗氧化活性,結果顯示,3種植物藥材均具有抗氧化性,且具有量效正相關性。苦刺花3法皆是甲醇部位大于二氯甲烷部位,表明其中的黃酮類成分抗氧化作用大于生物堿部位;或者是黃酮類成分的含量較高,酚羥基數量多,產生的抗氧化效果較強。苦參與山豆根則相反,二氯甲烷部位的抗氧化性強于甲醇部位,二者生物堿的含量相對較高,其抗氧化性較強。

3.2 實驗特色及注意事項

PTIO作為一種常用的一氧化氮清除劑,區別于其他自由基,其帶電基團為氧原子,DPPH為氮原子。PTIO易被還原,溶液由紫色褪為無色,反應程度與所接受的電子數為定量關系,因此可通過測量吸光度值進行定量分析。因3種植物藥材均為提取部位,成分復雜,為使抗氧化實驗結果精確,應選擇在最為合適的條件下進行實驗。故依據參考文獻[19]選取芥子堿、原花青素、鄰苯二酚3類不同結構類型的中藥小分子,用PTIO消除自由基檢測方法分別探討依據中藥小分子清除PTIO自由基的方法,得出結論為其清除PTIO自由基的能力以pH=7.0時為最強。由此可知,當反應液呈中性時,對PTIO的清除效果均較佳。借此條件,用 PTIO消除自由基的方法分析、比較3種同科植物的抗氧化活性及其構效關系,同時對抗氧化劑的研究也具有一定的指導意義,使其抗氧化性實驗的結果更加準確。

3.3 共性結果及建議

本次實驗所用的供試品為3種植物的不同溶劑提取部位,只能說明其含有總生物堿、總黃酮類成分,且皆具有抗氧化活性,其具體化學成分有待進一步深入研究,以進一步說明其作用機制。

4 結論

在最佳反應條件下,用DPPH法、ABTS法和PTIO法比較了山豆根、苦刺花、苦參不同提取物抗氧化能力的差異,結果表明,三者皆具有較強的體外清除自由基的能力,且具有量效正相關性。抗氧化作用與黃酮類、生物堿類成分的含量呈正相關性,奠定了三者相互替代的開發潛能;可為苦刺花資源的科學開發和綜合利用提供參考;為擴展3種藥材的臨床應用提供實驗依據。