比伐蘆定及其制劑生物活性的測定

穆 嬌,李 勇,張睿懿,張 偉*

1.昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室,昆明 650500;2.昆明龍津藥業股份有限公司,昆明 650503

冠心病是臨床常見的循環系統疾病,其發病率呈逐年上升的趨勢。目前,經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention, PCI)可有效改善患者的臨床癥狀,有利于患者預后,是治療冠心病的主要方法之一[1-3],但是當接受PCI治療的患者在面對抗凝藥的出血風險時需要權衡利弊,所以抗凝藥的選擇至關重要[4-7]。肝素是心血管手術的首選抗凝劑,但部分患者可能存在肝素誘導性血小板減少癥(heparin-induced thrombocytopenia, HIT)和肝素抗體陽性等情況[8-9]。

比伐蘆定(bivalirudin,CAS號為128270-60-0,相對分子質量為2 180.29,分子式為C98H138N24O33)為一種新型直接凝血酶抑制劑,是根據水蛭素蛋白序列設計、合成的20肽水蛭素衍生物,可通過抑制凝血酶來發揮抗凝作用,同時能快速與凝血酶脫離,使比伐蘆定迅速失效[10-12],經靜脈注射,5 min內即可達到峰質量濃度,停藥后1～2 h凝血功能即可恢復正常[13-15],對凝血酶的抑制作用有可逆性、短暫性和特異性等特點[16]。比伐蘆定可應用于經皮冠狀動脈腔內成型術(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)的不穩定型心絞痛、PCI、心肌梗死溶栓治療、外周血管介入治療(peripheral vascular interventional therapy, PPI)和心臟外科手術及肝素誘導的血小板減少癥(thrombocytopeniatherapy,HIT)等[17-19]。相比普通肝素,比伐蘆定不需要依賴抗凝血酶就能起到抗凝作用,不用進行血液監測,其半衰期較短,抗凝效果顯著優于普通肝素,還會降低不良出血事件及心血管事件的發生率,預后更佳[20-22]。

發色底物(chromogenic substrates)為化學合成的小肽,其一端為發色基團對硝基苯胺(p-nitroaniline, PNA),游離的PNA呈黃色,在405 nm波長處產生吸收峰,一定時間內,反應產物的吸光度值與酶活性呈線性相關[23]。向待檢供試品中加入過量凝血酶和比伐蘆定,剩余的酶可裂解產色物質并釋放PNA,游離PNA可用分光光度計或酶標儀檢測,監測其在405 nm處吸光度值的變化,便可測出酶的活性,從而確定比伐蘆定制劑的活性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

EPOCH2NS型酶標儀(美國伯騰有限公司);SECURA225D-ICN型分析天平(北京賽多利斯有限公司);FE28型pH計(梅特勒-托利多科技有限公司);Research plus型移液槍(德國艾本德有限公司)。

1.2 試藥

生色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNa·2HCl)(規格為25 mg,批號F2000197)、凝血酶(規格為100 IU,批號F2000915),均購自HYPHEN Bio Med公司;比伐蘆定對照品(質量分數>88.9%,批號C1-006/D1901F04)、比伐蘆定原料藥(質量分數>100.03%,批號ZM0220002),均購自成都圣諾生物制藥有限公司;注射用比伐蘆定(規格為250 mg,批號20210413,昆明龍津藥業股份有限公司);三(羥基甲基)氨基甲烷(批號20210118)、聚乙二醇6000(批號20201215),均購自國藥集團化學試劑有限公司;氯化鈉(批號2009081,西隴化工股份有限公司);乙二胺四乙酸二鈉鹽(批號2012251,四川西隴科學有限公司);水為純化水(自制)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1緩沖液的制備 稱取6.10 g三(羥基甲基)氨基甲烷、10.20 g氯化鈉、2.80 g乙二胺四乙酸二鈉鹽、1.0 g聚乙二醇6000,置于1 000 mL燒杯中,加純化水800 mL使溶解,用鹽酸調節pH值為8.4,用純化水稀釋至1 000 mL,混勻,即得。

2.1.2凝血酶溶液和發色底物工作溶液的制備 取1瓶含有100 IU凝血酶的凍干粉,加入純化水1 000 μL復溶,加入緩沖液9 000 μL,混勻,即得凝血酶溶液。

取1瓶含有25 mg發色底物的凍干粉,加入純化水9 000 μL復溶,混勻,作為發色底物儲備液,取發色底物儲備液460 μL,加純化水2 540 μL,混勻,即得發色底物工作溶液。

2.1.3對照品、供試品測試系列溶液的制備 精密稱定比伐蘆定對照品約10 mg,加緩沖液溶解并稀釋制成每1 mL中約含比伐蘆定100 μg的對照品儲備液。取比伐蘆定原料藥或制劑,加純化水適量使之溶解并稀釋制成質量濃度為100 μg·mL-1的溶液,作為供試品儲備液。用上述比伐蘆定對照品儲備液、比伐蘆定供試品儲備液按表1中的步驟進行稀釋得到各自的測試系列溶液。

表1 對照品、供試品測試系列溶液的稀釋步驟

2.2 測試程序與測試序列

以緩沖液為空白,在預熱至37 ℃±0.5 ℃的酶標儀中分別加入對照品測試系列溶液、供試品測試系列溶液,按表中程序和序列進行測試(平行測定2次)。見表2、表3。

表2 測試程序

表3 測試序列

2.3 計算方法

2.3.1凝血酶抑制率(TI)計算公式 對照品系列溶液、供試品系列溶液中被作用的凝血酶抑制率TI計算公式如下:

TIstandard=[(Ablank-Astandard)×100%]/Ablank

TIsample=[(Ablank-Asample)×100%]/Ablank

Ablank為各系列溶液對應空白吸光度值的平均值;Astandard為對照品每個質量濃度溶液吸光度值的平均值;Asample為供試品每個質量濃度溶液吸光度值的平均值。

以對照品系列溶液質量濃度、供試品系列溶液質量濃度的自然對數值為橫坐標,以TI為縱坐標,分別繪制對照品、供試品的線性回歸曲線。

根據對照品回歸方程,計算TI為45%時的對照品質量濃度,將該質量濃度代入供試品回歸方程,計算得到比伐蘆定TI。

2.3.2對照品、樣品回歸方程的回歸系數(斜率)之間差異性的顯著性檢驗 對照品、樣品2個斜率之間差異性的顯著性t檢驗公式如下。

式中,x對=lnC對:對照品4個質量濃度分別取自然對數值;x1=lnC1:樣品4個質量濃度分別取自然對數值;y對:對照品每個質量濃度點實測TI值;y1:樣品每個質量濃度點實測TI值;N對:對照品測試系列溶液個數(4);N1:樣品測試系列溶液個數(4);對照品、樣品回歸方程的2個斜率之間進行差異性的顯著性t檢驗,樣品回歸方程相關系數大于相關系數臨界值0.950(95%置信度),t

2.4 生物活性測定方法的建立

2.4.1線性與范圍 取比伐蘆定制劑,按照2.1.3項下方法制備對照品、供試品測試系列溶液,按照2.2項下的程序和序列分別進行吸光度值的測定。以質量濃度的自然對數值為橫坐標、以TI為縱坐標,進行線性回歸,計算相關系數。對照品溶液的線性方程為y1=17.228x1+24.045,相關系數為0.991 6(r>0.950),供試品溶液的線性方程為y2=16.598x2+26.412,相關系數為0.994 9(r>0.950),將對照品、樣品回歸方程的2個斜率進行差異性的顯著性t檢驗,得出t=0.32,表明對照品和供試品的線性關系良好,線性顯著,且TI符合要求。

2.4.2精密度 取比伐蘆定制劑,按照2.1.3項下方法制備對照品、供試品測試系列溶液,按照2.2項下的程序和序列,由不同實驗員在不同時間取同一批比伐蘆定供試品(平行配制6份),用酶標儀測定生物活性,其生物活性的RSD值分別為1.3%、2.7%,12份供試品均值(TI)為45.49%,以上12份供試品生物活性的RSD值為2.2%。結果表明精密度良好。

2.4.3準確度 取比伐蘆定制劑1瓶,按照2.1.3項下方法制備3個不同水平(50%溶液、100%溶液、150%溶液)的對照品、供試品測試系列溶液(平行配制3份),以45TI對應的對照品或供試品質量濃度(μg·mL-1)作為100%質量濃度點,將該質量濃度±50%作為50%、150%質量濃度點。按照2.2項下的程序和序列進行吸光度值的測定。結果表明,各質量濃度的回收率均在90%～110%范圍內,回收率的RSD值為2.0%,結果表明準確度良好。見表4。

表4 回收率測定結果

2.4.4耐用性 取同一批比伐蘆定供試品,通過調整測試條件參數(加入凝血酶孵育時間、孵育溫度、凝血酶加入量、發色底物加入量、發色底物混合時間、檢測時間)測定生物活性,生物活性的RSD值均小于5.0%,結果表明該方法耐用性較好。見表5。

表5 改變檢測參數所測得的比伐蘆定制劑生物活性

2.4.5穩定性 考察室溫放置24 h對照品儲備液、供試品儲備液的穩定性,取在室溫(25 ℃±2 ℃)量瓶中放置24 h的比伐盧定對照品儲備液、供試品儲備液,制備對照品系列溶液、供試品系列溶液。取新鮮配制的對照品系列溶液作為對照,測定0、24 h對照品溶液與供試品溶液的TI值,對照品、供試品24 h測定的結果與0 h比較,TI的差值絕對值為0.11%,表明對照品儲備液、供試品儲備液在室溫放置24 h內穩定。

2.4.6專屬性 制備0.01 mg·mL-1空白輔料溶液,以緩沖液作為空白溶液,按照2.2項下的程序和序列分別測定空白輔料溶液和空白溶液的吸光度值,結果顯示,空白輔料溶液對空白溶液檢測的干擾率為-5.3%。

3 討論

3.1 對照品、供試品測試系列溶液質量濃度的選擇

比伐蘆定質量濃度的自然對數與它的凝血酶抑制率(TI)呈線性關系,本方法選取系列質量濃度(1.25、2.5、5、10、20、40、60 μg·mL-1)進行測試,結果顯示,對照品、供試品質量濃度在1.25～10 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

3.2 用酶標儀測定比伐蘆定及其制劑生物活性的優點

目前,在注射用比伐蘆定標準號為YBH00142019和JX20160176的注冊標準中,關于生物活性的測定方法是用紫外-可見分光光度法測定生物活性,因為常規的紫外-可見分光光度法酶反應動力學速率受室溫影響很大,且無自身振搖功能、分子間接觸面積小、反應不充分,所以重復性差。在本實驗的測定過程中,用帶有恒溫和混合功能的酶標儀,使整個反應體系在(37 ℃±0.5 ℃)下反應,能嚴格模擬人體溫度,并且在96孔板中反應,反應體系小、效率高、節省時間,克服了現有方法中供試品前處理復雜的缺點,彌補了用紫外分光光度法檢測導致的檢測結果準確度和重復性差的不足。

本研究用一種簡便、快速、高效的方法進行比伐蘆定及其制劑生物活性的測定,既完善了該藥的質量控制標準,也能更有效地控制比伐蘆定及其制劑的質量。

3.3 實驗條件的控制

在開始測試前,需進行預熱,并進行空板反應,以增加反應體系中的生色底物和酶分子的接觸,使反應更加完全,更容易得到線性反應曲線。

由于凝血酶與生色底物的反應沒有終止劑,為得到更好的曲線,整個操作過程需更快、更準,以免人為操作影響實驗結果。另外,由于進板、出板時室溫會影響體系的反應程度,故需要打開空調以控制室溫,同時,操作者也需操作技術熟練、加樣準確。

所制備的凝血酶溶液、發色底物工作溶液、緩沖液均需置于2 ℃～8 ℃保存,在室溫(25 ℃±2 ℃)下放置30 min后使用。