一測多評法在大柴胡顆粒質量評價中的應用

陳 輝,周婷婷,柏 倩

海安市中醫院藥劑科,海安 226600

大柴胡顆粒源于漢代張仲景《傷寒論》中記載的大柴胡湯,主要由柴胡、黃芩、大黃、枳實、芍藥、半夏、大棗、生姜8味藥組成,其中柴胡和黃芩為君藥,大黃和枳實為臣藥,芍藥和半夏為佐藥,大棗和生姜為使藥。大柴胡顆粒是將大柴胡湯用現代制藥工藝提取后經噴霧干燥制成的顆粒制劑,功效與大柴胡湯相同,具有和解少陽、內瀉熱結的功效[1]。臨床常用大柴胡顆粒治療因少陽不和和肝膽濕熱所致的口苦、舌紅苔黃膩、大便秘結、膽囊炎等[2-3]。此外,大柴胡顆粒對血糖、血脂和血壓具有較好的調節作用,可有效緩解腦出血癥狀,減輕或消除肺部感染[4]。目前關于大柴胡顆粒有效成分含量測定的報道有限,并且《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中尚無其質量標準的記載,因此繼續完善大柴胡顆粒的質量標準對于提高其質量控制標準有重要意義。中藥成分復雜多樣,單一成分定量很難全面地進行質量控制,多組分定量則更為科學、可靠。一測多評法(quantitative analysis of multi-components by single-marker method, QAMS)基于中藥成分內在函數及比例關系,用廉價、易得的對照品同時實現多種成分的定量控制,已逐漸被業內學者和制藥工業認可,近年來已被用于多種中藥的質量評價,而且被2020年版《中國藥典》收載。QAMS不但適用于同類化合物(如黃酮類、皂苷類等)的質量控制[5],而且適用于不同種類化合物的質量控制[6-7]。本研究以黃芩苷為對照,用QAMS同時測定大柴胡顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的含量,為提高大柴胡顆粒的質量控制標準提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Alliance e2695型液相色譜儀、Waters XBridge C18(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)色譜柱(美國Waters公司);Agilent-1260型液相色譜儀(美國Agilent公司);Thermo Ultimate 3000型標準雙系統液相色譜儀、Thermo Hypersil GOLD(150 mm×4.6 mm,3 μm)色譜柱(美國Thermo Fisher公司);MS204TS/02型和XSE105DU型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q純水系統(美國Millipore公司);TGL 16G型離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥

對照品:柴胡皂苷B1(批號190621-009,質量分數為98.34%)、柴胡皂苷B2(批號58316-41-9,質量分數為99.6%),均購自成都德思特生物技術有限公司;漢黃芩素(質量分數>99.0%)、漢黃芩苷(質量分數>98.0%)、黃芩苷(質量分數>94.0%)、黃芩素(質量分數>97.0%),均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇為色譜純;水為超純水;磷酸等試劑均為分析純。

大柴胡顆粒(批號:100103、110801、110802,精華制藥集團股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2對照品適量,加甲醇配制成各對照品儲備溶液(質量濃度均為1 mg·mL-1)。分別精密量取上述各對照品儲備液適量,置于同一量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,配制成黃芩苷100 μg·mL-1、漢黃芩苷20 μg·mL-1、黃芩素5 μg·mL-1、漢黃芩素2 μg·mL-1、柴胡皂苷B12 μg·mL-1和柴胡皂苷B24 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取大柴胡顆粒細粉約1.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加入10 mL體積分數為75%的甲醇,密塞,稱定質量,超聲,用體積分數為75%的甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過。吸取5 mL濾液,置于25 mL量瓶中,加體積分數為75%的甲醇至刻度,密塞,搖勻,濾過,將濾液離心,取上清液,經0.45 μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。

2.3 陰性對照溶液的制備

除柴胡和黃芩外,其他藥材按大柴胡顆粒原配方比例稱取,按其生產工藝分別制成柴胡陰性樣品顆粒(不含柴胡)、黃芩陰性樣品顆粒(不含黃芩)以及黃芩和柴胡陰性樣品顆粒(不含柴胡和黃芩),按照2.2項下的方法制備各陰性對照品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18柱。流動相為甲醇(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B),梯度洗脫(0～5 min,10% A;5～20 min,10%～45% A;20～45 min,45%～80% A;45～50 min,80%～90% A;50～52 min,90% A;52～55 min,90%～10% A;55～60 min,10% A)。流速為0.4 mL·min-1,檢測波長為254 nm,柱溫為35 ℃,進樣體積為10 μL,分析時間為60 min。

2.5 專屬性考察

取供試品溶液、對照品溶液和各陰性對照品溶液,按照2.4項下色譜條件測定。6個成分色譜峰均可達到基線分離,與相鄰色譜峰分離度均>1.5,表明分離度良好,并且陰性對照溶液對測定無干擾。見圖1。

注:1.黃芩苷;2.漢黃芩苷;3.黃芩素;4.漢黃芩素;5.柴胡皂苷B2;6.柴胡皂苷B1;A.供試品溶液;B.混合對照品溶液;C.黃芩陰性對照品溶液;D.柴胡陰性對照品溶液;E.黃芩和柴胡陰性對照品溶液;F.空白輔料對照品溶液。

2.6 精密度

精密吸取混合對照品溶液,按照2.4項下色譜條件連續進樣6次,測定并計算6種成分的保留時間、相對峰面積及相對標準偏差(RSD)。黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2峰面積的RSD值分別為2.13%、1.23%、1.55%、1.68%、1.84%、1.95%,保留時間的RSD值分別為1.82%、1.25%、2.34%、1.46%、1.75%、2.21%,表明儀器的精密度良好。

2.7 線性范圍考察

精密吸取2.1項下制備的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2對照品儲備溶液適量,梯度稀釋為6個質量濃度對照品溶液,按照2.4項下色譜條件測定各化合物的峰面積。分別以各化合物的質量濃度和峰面積進行線性回歸,得到線性回歸方程和相關系數,見表1。

表1 各成分的線性關系考察結果

2.8 重復性

取同一批大柴胡顆粒供試品6份,按照2.2項下的方法制備供試品溶液,按照2.4項下色譜條件進樣,每份樣品各進樣1次,考察6種化合物的特征峰保留時間和峰面積,計算RSD值。計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2含量的RSD值分別為2.12%、1.84%、1.56%、2.13%、2.25%、1.84%,保留時間的RSD分別為1.88%、1.64%、2.15%、1.84%、1.87%、2.29%,表明該方法的重復性良好。

2.9 穩定性

取大柴胡顆粒供試品1份,按照2.2項下方法制備供試品溶液,于0、4、8、12、24、36、48 h按照2.4項下色譜條件進樣,考察6種化合物特征峰的保留時間和峰面積,計算RSD值。計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2含量的RSD值分別為1.86%、1.59%、1.86%、1.88%、1.73%、2.07%,保留時間的RSD值分別為2.04%、1.75%、1.49%、1.93%、1.54%、1.79%,表明6種成分的溶液在48 h內穩定。

2.10 加樣回收率

取已知黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2含量的大柴胡顆粒粉末約0.5 g,精密稱定,共6份,分別精密加入黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2對照品,使所加入的對照品的質量和供試品中各成分的含量基本一致,按照2.2項下的方法制備供試品溶液,按照2.4項下色譜條件進樣,測定和計算6種化合物峰面積的RSD值。結果顯示,6種化合物的加樣回收率在100.38%～102.00%范圍內,6種成分的RSD值在1.29%～1.82%范圍內,表明該方法的準確度良好。結果見表2。

表2 大柴胡顆粒中6種化合物的加樣回收率結果 (n=6)

2.11 色譜峰定位的確定

2.11.1色譜峰定位 取2.1項下制備的混合對照品溶液,分別精密吸取不同體積(5、10、15 μL)分別進樣3次,按照2.4項下色譜條件進樣,以黃芩苷為內標,測定漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的相對保留時間(Rt),取其平均值作為最終的結果。結果表明,漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相對于黃芩苷的相對保留時間分別為1.443、2.066、2.684、4.577、4.322,RSD值均≤2.33%,表明各化合物的相對保留時間波動較小。結果見表3。

表3 大柴胡顆粒中漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的相對保留時間 (n=9)

2.11.2色譜峰定位的重復性考察 取2.1項下的混合對照品溶液,按照2.4項下色譜條件進樣,分別考察Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀、Agilent-1260型高效液相色譜儀和Thermo Ultimate 3000 型高效液相色譜儀3種高效液相色譜系統以及Waters XBridge C18和Thermo Hypersil GOLD對5種化合物色譜峰定位的影響。結果表明,漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相對于黃芩苷的相對保留時間分別為1.451、2.070、2.688、4.586、4.321,RSD≤2.38%,表明各化合物的色譜峰定位在不同的超高效液相色譜儀和不同色譜柱間具有良好的重復性。結果見表4。

表4 不同高效液相儀器和色譜柱下漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的相對保留時間 (n=6)

2.12 相對校正因子(RCF)的確定

2.12.1RCF的計算方法 取2.1項下制備的混合對照品溶液,分別精密吸取不同體積(5、10、15 μL)分別進樣3次,按照2.4項下色譜條件進樣,以黃芩苷為內標,測定漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2峰面積的RCF,取其平均值作為最終的結果。RCF=(Cs×Ak)/(Ck×As),Cs為參照物黃芩苷的質量濃度,As為參照物色譜峰的峰面積,Ck和Ak分別為漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的質量濃度和峰面積。結果表明,漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相對于黃芩苷的相對校正因子平均值分別為0.773、0.519、0.579、1.081、0.834,RSD值均≤1.33%,表明相對校正因子波動較小。結果見表5。

表5 大柴胡顆粒中漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相對于黃芩苷的RCF (n=9)

2.12.2RCF的重復性考察 取混合對照品溶液,按照2.4項下色譜條件進樣,分別考察Waters Acquity 超高效液相色譜儀、Eksigent Ekspert Ultra LC 100型超高效液相色譜儀和Thermo Scientific Vanquish超高效液相色譜儀3種高效液相色譜系統以及Waters XBridge C18和Thermo Hypersil GOLD對5種化合物RCF的影響。結果表明,在各種條件下漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的RCF分別為0.771、0.519、0.577、1.080、0.837,RSD值均≤1.54%,表明各化合物的RCF在不同高效液相色譜儀與不同色譜柱間重復性良好。結果見表6。

表6 不同高效液相儀器和不同色譜柱下各成分相對于黃芩苷的RCF (n=6)

2.13 樣品的測定及驗證

取6批大柴胡顆粒,按照2.2項下方法制備供試品溶液,按照2.4項下色譜條件進樣,用外標法(ESM)和QAMS法測定6種化合物的含量,結果見表7。結果顯示,2種測量方法所得結果的RSD值均≤1.48%,表明QAMS 法可作為大柴胡顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的質量控制方法。該方法準確、可靠。

表7 一測多評法與外標法測定大柴胡顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的含量結果

3 討論

3.1 指標性成分的選擇

大柴胡顆粒中柴胡和黃芩為君藥,為了整體、全面地評價和控制其質量,以君藥(柴胡和黃芩)的有效成分作為指標成分對其質量進行控制。2020年版《中國藥典》對柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量進行控制[8]。但大柴胡顆粒制備過程中柴胡為水煎提取,柴胡皂苷的原型成分易轉化為次生皂苷,且在酸性洗脫系統下易發生結構轉化,因此選擇柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2作為柴胡質量控制的指標。黃芩味苦、性寒,有清熱燥濕、瀉火解毒的功效,藥效學研究表明主要是黃酮類化合物(包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素)發揮藥理作用,因此選擇以上4種黃酮類化合物對黃芩進行質量控制。

3.2 內參的選擇

QAMS僅需1個價廉、易得的有效成分, 即可實現多成分的同步測定[9]。藥效學研究表明,黃芩中的主要藥效成分為黃酮類化合物,黃芩苷的含量高、性質穩定、價格低廉,同時黃芩苷已成為黃芩飲片、小柴胡顆粒和大柴胡顆粒等質量控制的檢測指標,現代藥理研究表明,黃芩苷具有顯著的生物活性[10]。因此,本研究選擇黃芩苷作為QAMS的內標物。

3.3 流動相和檢測波長的選擇

本研究篩選了多種流動相(包括甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸、乙腈-1 mL·L-1冰醋酸等),其中甲醇-1 mL·L-1磷酸基線比較平穩,黃芩苷在酸性條件下較純水的峰形更尖銳,靈敏度更高。另外,考慮到色譜柱對酸的耐受性,最終選擇甲醇-1 mL·L-1磷酸作為流動相。在200～350 nm波長范圍內對6種成分進行掃描,黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的最大吸收波長分別為278、274、276、276、254、252 nm。在252、254、276、276 nm處對大柴胡顆粒供試品溶液的紫外吸收情況進行分析,最終選擇各化合物響應最好的254 nm作為檢測波長。