千金藤素基于Akt/mTOR通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞自噬

郭 潔,李 晶,湯麗麗,劉 蓉

1.邯鄲市第一醫(yī)院婦三科,邯鄲 056002;2.邯鄲市第一醫(yī)院紡醫(yī)院麻醉科,邯鄲 056002

宮頸癌為女性第二常見惡性腫瘤[1]。在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及治療中,細(xì)胞自噬發(fā)揮著重要作用[2]。自噬為真核生物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象之一,一方面能滿足細(xì)胞代謝及某些細(xì)胞器更新的需要,另一方面也可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)自噬性死亡,可能成為腫瘤治療中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)[3]。千金藤素為傳統(tǒng)中藥千金藤的活性成分,是一類異喹啉類生物堿,具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、穩(wěn)定質(zhì)膜及抗腫瘤等藥理學(xué)作用[4]。研究顯示[5-6],千金藤素在口腔鱗狀細(xì)胞癌、膽管癌及肺癌等多種惡性腫瘤的治療中發(fā)揮作用,可抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究重點(diǎn)分析了千金藤素對(duì)宮頸癌細(xì)胞自噬的作用,并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LVEM5型臺(tái)式投射電子顯微鏡(美國(guó)Delong Instruments公司);SpectraMax M3型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

千金藤素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,上海源葉生物科技有限公司);四唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法試劑盒(美國(guó)Biovision公司);吖啶橙(acridine orange,AO)染色試劑盒(美國(guó)Sigma公司);實(shí)時(shí)熒光定量分析(real-time fluorescence quantitative analysis,RT-PCR)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司);二奎啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)蛋白試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司);兔抗人磷酸化丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1(phosphorylated pyruvate dehydrogenase kinase 1,p-PDK1)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)一抗及山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗均購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及分組

取人宮頸癌HeLa細(xì)胞株,以12 000 r·min-1離心10 min,離心半徑為8 cm。置于含50 mg·L-1胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種,在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),生長(zhǎng)至70%匯合度進(jìn)行傳代。取第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞,密度調(diào)整為 1.0×104個(gè)·mL-1,在96孔板接種。細(xì)胞分為4組,千金藤素低劑量、中劑量及高劑量組分別以15、30、60 μmol·L-1千金藤素溶液處理24 h,對(duì)照組以等量生理鹽水處理24 h。

2.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

用MTT法檢測(cè)。取2.1項(xiàng)下4組細(xì)胞,將細(xì)胞密度調(diào)整至1.0×104個(gè)·mL-1,在96孔板接種,復(fù)孔數(shù)均為5,另設(shè)空白孔,空白孔內(nèi)僅加入培養(yǎng)液20 μL。各組培養(yǎng)24、48、72 h時(shí),在孔內(nèi)加5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨后將各孔培養(yǎng)上清液清除干凈,加入DMSO 150 μL,振蕩8 min。待細(xì)胞內(nèi)的紫藍(lán)色結(jié)晶溶解后,用酶標(biāo)儀檢測(cè),測(cè)定各組在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A),評(píng)估細(xì)胞增殖活性。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。取2.1項(xiàng)下4組細(xì)胞,在96孔板內(nèi)接種,復(fù)孔數(shù)均為5。觀察細(xì)胞貼壁后,加入不含EDTA的胰酶消化。用EP管收集細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液沖洗。管內(nèi)加 1×binding buffer 200 μL重懸細(xì)胞,在細(xì)胞重懸液內(nèi)加入Annexin V-PE 5 μL,混勻,避光條件下孵育10 min。將7-AAD 5 μL加入各管,吹打混勻。以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡數(shù)量,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞的數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量)×100%。

2.4 自噬溶酶體數(shù)量檢測(cè)

用AO染色法檢測(cè)。取2.1項(xiàng)下4組細(xì)胞,在24孔板接種,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,以1 mg·L-1AO溶液染色15 min,避光,PBS清洗3次。鏡下觀察自噬溶酶體生成情況,無自噬溶酶體產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)在鏡下呈綠色熒光,含自噬溶酶體者呈紅色熒光。

2.5 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)

用RT-PCR法檢測(cè)。取2.1項(xiàng)下4組細(xì)胞,Trizol法提取總RNA,紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)吸光度,進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。用GeneBank基因庫(kù)內(nèi)大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)、Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域蛋白(Bcl-2 homologous domain protein,Beclin1)及p62基因序列,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL ,上游引物1 μL,下游引物1 μL, cDNA 1.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,30 s;72 ℃,10 min。共40個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)為L(zhǎng)C3-Ⅱ F(5′-AGAGAGGAGGTGAGCTGAGA-3′),R(5′-GAA-GGAGATGGAGACTAGGT-3′);Beclin1 F(5′-ACCACAGTTGAACAGTACCGCCGAAGTGTATG-3′),R(5′-ACAGTTGAGCCGAAGTGTATGGTACCA-CCACA-3′);p62 F(5′-TGTGAACCCTCGTCTTA-TCGC-3′),R(5′-AGGCGACTCACGGTCCTAAC-3′);β-actin F(5′-TACGATTCTCCCATCAACT-3′),R(5′-GTCTGGTAATCTCGCACTC-3′)。瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶,以2-△△CT計(jì)算LC3-Ⅱ、Beclin1及p62 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.6 蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。取2.1項(xiàng)下4組細(xì)胞,PBS洗滌,加RIPA裂解液,制備勻漿,離心。考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),加2×上樣緩沖液,沸水浴變性10 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂奶粉封閉1 h,洗膜。加兔抗人p-PDK1(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)及p-mTOR(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,洗膜。加山羊抗兔IgG二抗(1∶2 500),室溫孵育,2 h,洗膜。Image Quant LAS4000生物分子成像儀顯影曝光,檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量,目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶的灰度值/β-actin條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖活性

MTT實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖活性各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);各組細(xì)胞增殖活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高(P<0.05)。與對(duì)照組比較,千金藤素3組細(xì)胞增殖活性降低,且高劑量組<中劑量組<低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組MTT實(shí)驗(yàn)A值比較

3.2 細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞凋亡率各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,千金藤素3組細(xì)胞凋亡率升高,低劑量組<中劑量組<高劑量組(P<0.05)。見圖1、表2。

注:A.對(duì)照組;B.千金藤素低劑量組;C.千金藤素中劑量組;D.千金藤素高劑量組。

表2 各組細(xì)胞凋亡率的比較

3.3 自噬溶酶體

對(duì)照組HeLa細(xì)胞內(nèi)亮紅色熒光比例較低,自噬溶酶體的數(shù)量較少,自噬程度低。與對(duì)照組比較,千金藤素3組亮紅色熒光比例升高,自噬溶酶體的數(shù)量增多,自噬程度增強(qiáng),低劑量組<中劑量組<高劑量組。見圖2。

注:A.對(duì)照組;B.千金藤素低劑量組;C.千金藤素中劑量組;D.千金藤素高劑量組。

3.4 LC3-Ⅱ、Beclin1及p62 mRNA的表達(dá)水平

LC3-Ⅱ、Beclin1及p62 mRNA表達(dá)各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,千金藤素3組LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA的表達(dá)水平升高,p62 mRNA的表達(dá)水平降低,且比較LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA的表達(dá)水平,低劑量組<中劑量組<高劑量組;比較p62 mRNA的表達(dá)水平,高劑量組<中劑量組<低劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 各組LC3-Ⅱ、Beclin1及p62 mRNA表達(dá)水平的比較

3.5 蛋白相對(duì)表達(dá)量

p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與對(duì)照組比較,千金藤素3組p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低,高劑量組<中劑量組<低劑量組(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 各組p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白表達(dá)比較

表4 各組p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

4 討論

宮頸癌是人乳頭狀瘤樣病毒E6和E7蛋白與細(xì)胞癌基因、抑癌基因相互作用引發(fā)的一系列病理改變,導(dǎo)致細(xì)胞永生化而引發(fā)的癌變[7-8]。自噬與癌癥進(jìn)展有關(guān),是一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,主要是細(xì)胞經(jīng)自噬體與溶酶體結(jié)合、對(duì)自身受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)進(jìn)行降解的過程,近年來逐漸成為治療癌癥新的靶點(diǎn)[9]。中醫(yī)古籍中沒有宮頸癌病名,古代醫(yī)家根據(jù)癥狀多將其納入“崩漏”“癥瘕”及“五色帶下”等范疇,該病屬本虛標(biāo)實(shí)之證,本為正氣虛弱、沖任失調(diào),標(biāo)為濕熱瘀毒凝結(jié),治療的關(guān)鍵包括抗癌解毒、活血化瘀、散結(jié)利濕、理氣解郁等[10]。

千金藤屬防己科植物,可清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)、祛風(fēng)利濕,其有效成分千金藤素是一種天然生物堿,具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等抗腫瘤作用,且具有毒性低、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)[11]。項(xiàng)福英等[12]研究發(fā)現(xiàn),千金藤素可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬。鄧琴等[13]提出,千金藤素能通過阻斷自噬體與溶酶體的融合,發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞自噬體降解的作用。但目前千金藤素對(duì)宮頸癌細(xì)胞自噬的作用尚未完全闡明。本研究發(fā)現(xiàn),用千金藤素處理后,宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖活性降低、細(xì)胞凋亡率上升、自噬溶酶體的數(shù)量增多、自噬活性標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA的表達(dá)水平升高、p62 mRNA的表達(dá)水平降低,并呈一定劑量依賴性,表明千金藤素可誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬、降低細(xì)胞增殖活性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其可作為治療宮頸癌的潛在藥物應(yīng)用于臨床。

細(xì)胞自噬受多種信號(hào)分子及信號(hào)通路調(diào)控,其中mTOR是與自噬相關(guān)的信號(hào)通路交匯節(jié)點(diǎn),特別是Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞自噬有一定負(fù)調(diào)控作用[14-15]。Akt/mTOR信號(hào)通路中核心蛋白mTOR的活化可影響自噬體的形成及成熟,該通路激活后可進(jìn)一步激活下游mTOR的功能,發(fā)揮抑制細(xì)胞自噬作用[16]。李沫等[17]研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活可能是抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬的重要作用機(jī)制之一。PDK1在多種腫瘤發(fā)生中有一定作用,靶向PDK1有望成為腫瘤治療的重要手段[18]。研究顯示[19],由PDK1介導(dǎo)的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在多種癌癥中發(fā)揮重要作用,且PDK1在大部分腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)。還有研究表明[20],PDK1可激活PI3K/Akt信號(hào)通路,該通路可進(jìn)一步激活mTOR,從而抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生。這些研究提示,PDK1介導(dǎo)Akt/mTOR信號(hào)通路可能在宮頸癌細(xì)胞自噬中發(fā)揮一定作用。本研究結(jié)果顯示,用千金藤素處理后,宮頸癌HeLa細(xì)胞p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低,且效果呈一定劑量依賴性,表明千金藤素可抑制PDK1介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路,推測(cè)這是千金藤素誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞自噬的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述,千金藤素可誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬、降低細(xì)胞增殖能力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與抑制PDK1介導(dǎo)的Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān),但本研究并未就其他作用機(jī)制進(jìn)行分析,存在一定不足,今后仍需進(jìn)一步深入研究。