黃腐酚抑制膝骨關節炎大鼠軟骨組織細胞自噬作用

胡 杰,杜巖松,王萬宏

1.唐山市工人醫院風濕免疫科,唐山 063000;2.石家莊欒城人民醫院骨科,石家莊 051430;3.唐山市豐南區醫院神經外科,唐山 063300

膝骨關節炎(knee osteoarthritis, KOA)是一種臨床常見的關節風濕性疾病,以膝關節疼痛、腫脹、關節僵硬、喪失活動能力和關節軟骨細胞病變壞死為主要病理特點[1]。軟骨細胞作為關節軟骨的唯一細胞,僅靠關節液中的營養合成細胞外基質維持關節軟骨的健康平衡,軟骨細胞的凋亡和外基質缺失是KOA病程進展的關鍵環節[2]。黃腐酚(xanthohumol)是從啤酒花中提取的天然多酚物質,約占啤酒花干質量的1%,具有抗氧化、抗癌等多種藥理作用,中醫臨床中常用于治療糖尿病、消化系統疾病等[3-4]。研究表明,黃腐酚對細胞凋亡和自噬水平均有影響[5]。本研究通過建立KOA大鼠模型,探討黃腐酚對KOA大鼠軟骨損傷的修復作用和對軟骨細胞自噬水平的影響及其可能的作用機制,旨在為黃腐酚藥物開發及臨床治療骨關節炎提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Bio-Tek Elx800型全自動酶標儀(美國Bio-Tek公司);CFX Connect型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

黃腐酚(質量分數為98%,批號B20557,規格為20 mg,上海源葉生物科技有限公司);硫酸氨基葡萄糖膠囊(維固力膠囊,規格為0.25 g,羅達藥廠);白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assy,ELISA)試劑盒均購自英國Abcam公司;兔抗β-actin多克隆抗體、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、哺乳動物雷帕霉菌靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、哺乳動物ATG同源蛋白(mammalian ATG homologous protein, Beclin 1)、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3-Ⅱ)多克隆抗體和山羊抗兔二抗免疫球蛋白G(immunoglobulin,IgG)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

60只7～8周齡SPF級雄性SD大鼠,動物來源于河北醫科大學實驗動物中心,合格證號為SCXK(冀)2020-002。體質量為220～250 g,所有大鼠于相同環境飼養,用標準飼料和清潔水源喂養7 d,定期更換墊料,保持良好通風。環境條件設置為溫度20～24 ℃、相對濕度(50%±10%)。

2 方法

2.1 KOA大鼠模型建立

適應性飼養7 d后,選取48只大鼠用前后交叉韌帶斷離術建立KOA模型[6],腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,仰臥位固定于手術臺上,選取兩側膝關節內側部位,將手術部位腿毛剃除并消毒,無菌條件下縱向切開皮膚,暴露出整個膝關節,找到髕腱內緣切開關節囊,鈍性分離結締組織、血管,彎曲膝關節,切斷前交叉韌帶,切除內側半月板,保留關節軟骨面以避免損傷。用生理鹽水沖洗關節腔,抽屜實驗陽性后快速止血,逐層縫合手術傷口,無菌包扎。術后連續3 d注射青霉素,預防感染,每日驅趕大鼠迫使其運動30 min,觀察大鼠狀態,出現膝關節腫脹、行走不便或跛行,表示建模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功大鼠隨機分為模型組、黃腐酚低劑量、黃腐酚高劑量組和西藥組;其余大鼠作為對照組(12只)。參照文獻方法[7-8],黃腐酚低劑量、高劑量組分別灌胃50、100 mg·kg-1黃腐酚混懸液(用生理鹽水配制),西藥組灌胃0.17 g·kg-1硫酸氨基葡萄糖膠囊,對照組及模型組給予等量生理鹽水,各組每日給藥1次,連續給藥28 d。

2.3 標本采集

末次給藥后禁食24 h,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,開腹,經腹主動脈采集血液,靜置30 min,于4 ℃以3 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為12 cm),分離血清,-20 ℃保存。采血完畢后,脊椎脫臼法處死大鼠,分離左側膝關節,剔除周圍肌肉和脂肪組織,取出軟骨組織,剪取部分置于無菌凍存管中,-80 ℃保存備用,其余軟骨組織置于4 g·mL-1多聚甲醛液中固定24 h,備用。

2.4 大鼠軟骨組織Mankin’s評分

將制好的軟骨組織切片置于光學顯微鏡下觀察形態變化,根據軟骨組織結構完整性、軟骨細胞數量和潮線完整性,用Mankin’s軟骨損傷組織學評定標準對大鼠關節軟骨組織病變程度進行評分,各分數相加為最終得分。評分越高表示KOA病變的程度越嚴重,詳細評定標準見表1。

2.5 血清炎癥因子水平檢測

按照IL-6、IL-1β和TNF-α試劑盒說明書操作。取出相關板條,設置樣品孔與標準孔,樣品孔加入待測樣本10 μL和稀釋液40 μL,標準孔中加入不同質量濃度對照品稀釋液50 μL。于各板孔中再加入酶標抗體100 μL,37 ℃水浴鍋加熱60 min,棄液拍干吸去多余液體后,各板孔中加入顯色A液和B液各50 μL,37 ℃水浴鍋加熱10 min。最后加入終止液50 μL,用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度值,根據對照品梯度質量濃度繪制對照品線性回歸曲線,計算各樣本的質量濃度。

2.6 軟骨組織HE染色觀察

將固定24 h的軟骨組織取出,置于脫水盒中脫去組織水分,二甲苯中透明。完全浸入石蠟中包埋,-20 ℃冷凍臺冷卻凝固,修整蠟塊切成厚5 μm的薄片。切片放入二甲苯、無水乙醇和梯度乙醇溶液中進行脫蠟復水,浸入蘇木精染色液10 min,流水沖洗1 min,鹽酸分化1 s,氨水返藍后再次用流水沖洗,伊紅染液染色2 min,清水沖洗3 min,脫水透明,滴加中性樹脂封固,保存。在光學顯微鏡下觀察軟骨組織病理變化并拍照。

2.7 軟骨組織TUNEL染色觀察

室溫下將軟骨組織切片浸入二甲苯脫蠟5 min,浸入梯度體積分數乙醇脫水3 min,PBS潤洗切片,嚴格按照TUNEL試劑盒說明書操作,吸干多余液體后滴加配制好的20 μg·mL-1Proteinase工作液100 μL,室溫孵育20 min,PBS沖洗,再加入顯色劑,封膜孵育20 min,PBS沖洗3次,復染后封片,光學顯微鏡下移動切片觀察軟骨組織神經細胞凋亡情況,用Image J軟件處理數據,統計細胞總數和呈現棕黃色的凋亡陽性細胞數,計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=(陽性細胞數量/總細胞數量)×100%。

2.8 RT-PCR檢測mRNA表達

取出軟骨組織,按照RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA,用分光光度計檢測RNA的質量濃度。按照反轉錄試劑盒說明書配制逆轉錄體系合成cDNA。用cDNA配制PCR反應體系(19.2 μL)。上、下游引物各0.4 μL,SYBR Premix Ex Tap 10 μL,ROX Refermce Dye Ⅱ 0.4 μL,cDNA 2 μL,RNase free ddH2O 6 μL。反應條件為95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,40個循環。取樣本CT值平均數,以目的基因相對內參的表達量計算各樣本中基因的相對表達水平,2-△△CT為各樣本基因的表達水平。引物序列為PI3K-F: 5′-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3′、PI3K-R: 5′-GGCTACAGTAGTGGGCTTGG-3′;Akt-F:5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′、Akt-R:5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′;mTOR-F:5′-CAGTTCGCCAGTGGACTGAAG-3′、mTOR-R:5′-GCTGGTCATAGAAGCGAGTAGAC-3′;以β-actin為內參,β-actin-F: 5′-GGCTGTATTCCCCTCCAT-CG-3′、β-actin-R: 5′-CCAGTTGGTAACAATGCC-ATGT-3′。

2.9 Western blotting檢測蛋白表達

取軟骨組織,加入RIPA細胞裂解液進行裂解,制成勻漿后提取總蛋白,用BCA蛋白質量濃度試劑盒測定質量濃度。按照蛋白上樣量為40 μL,加入配制好的分離膠與濃縮膠,恒壓75 V電泳40 min,恒壓120 V電泳至溴酚藍及Marker位置即停止。轉至PDVF膜,TBST漂洗5 min,加入脫脂牛奶于搖床中封閉2 h,再加入1∶1 000稀釋一抗,于4 ℃搖床孵育,TBST漂洗5 min,加入1∶2 000稀釋二抗,室溫搖床封閉60 min,TBST漂洗,滴加顯影液進行顯影,避免曝光,保存圖像,以β-actin為內參,觀察條帶上相應的蛋白表達量并對目的條帶吸光度值進行計算、分析。

2.10 統計學方法

3 結果

3.1 軟骨組織學評分比較

與對照組比較,模型組大鼠Mankin’s評分升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠的Mankin’s評分均降低(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠Mankin’s評分均降低(P<0.05),后2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 大鼠軟骨組織學Mankin’s評分的比較

3.2 血清炎癥因子水平比較

與對照組比較,模型組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05),后2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平的比較

3.3 軟骨組織HE染色比較

結果顯示,對照組大鼠膝關節軟骨組織形態未見明顯異常,結構完整,軟骨表面光滑,基質均勻,細胞形態正常、排列整齊,各層細胞均未見破壞,未見細胞腫脹和炎性細胞浸潤等現象。模型組大鼠關節軟骨組織結構破壞嚴重,軟骨淺層出現明顯缺失及裂縫,裂隙深達鈣化層,深層細胞排列紊亂,潮線破壞情況嚴重,可見大量細胞增生,炎性細胞浸潤。3個給藥組大鼠關節軟骨組織結構受損現象得到改善,表層逐漸平整光滑,結構清晰,偶見微小裂隙,軟骨細胞及細胞核形態正常且排列整齊,細胞腫脹和增生情況減少,炎性細胞明顯減少。見圖1。

注:A.對照組;B.模型組;C.黃腐酚低劑量組;D.黃腐酚高劑量組;E.西藥組。

3.4 軟骨組織細胞凋亡率比較

與對照組比較,模型組大鼠軟骨細胞凋亡率升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠軟骨細胞凋亡率降低(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠軟骨細胞凋亡率降低(P<0.05),后2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖2。

注:A.對照組;B.模型組;C.黃腐酚低劑量組;D.黃腐酚高劑量組;E.西藥組。

表4 各組大鼠軟骨組織細胞凋亡率的比較

3.5 mRNA水平比較

與對照組比較,模型組大鼠軟骨組織PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠軟骨組織PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達水平降低(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠軟骨組織PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達水平降低(P<0.05),后2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 PI3K、Akt和mTOR mRNA水平的比較

3.6 蛋白水平比較

與對照組比較,模型組大鼠軟骨組織PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表達水平升高,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠軟骨組織PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表達水平降低,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平升高(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠軟骨組織PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表達水平降低,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平升高(P<0.05),后2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表6、圖3。

注:A.對照組;B.模型組;C.黃腐酚低劑量組;D.黃腐酚高劑量組;E.西藥組。

表6 PI3K、Akt、mTOR、Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平的比較

4 討論

關節軟骨屬于透明軟骨,能減少相鄰兩骨之間的摩擦,對緩沖運動時產生的壓力起重要作用。KOA的發病機制較為復雜,研究表明其發病不僅是因為關節退化,而且與關節軟骨細胞凋亡與自噬水平、滑膜和關節周圍組織均存在密切聯系[9]。KOA雖屬于慢性退化疾病,病程較為緩慢,但前期若不及時給予藥物干預,會引起膝關節功能喪失,產生嚴重形變,后期疼痛會嚴重影響患者的生活質量[10]。此外,KOA還會大大增加患者患心血管疾病的風險[11]。黃腐酚具有抗癌、減脂和保護心血管的作用[12-13]。黃腐酚作為高效氧化活性的生物成分,可通過調控細胞自噬相關通路蛋白的水平來抑制細胞凋亡[14]。用前后交叉韌帶斷離術建立KOA模型準確性高、干擾因素少、造模時間短、成本低,通過改變關節內平衡狀態造成關節受力失衡誘發KOA,其病程與人類KOA相似[15]。故本研究用前后交叉韌帶斷離術建立KOA大鼠模型,從分子機制上探討黃腐酚對關節炎大鼠軟骨細胞自噬水平的影響。結果顯示,模型組大鼠軟骨組織學Mankin’s評分和血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平及細胞凋亡率均升高,表明模型組大鼠軟骨組織受到損傷且伴有炎癥反應,KOA模型建立成功。不同劑量黃腐酚和西藥治療后大鼠均表現軟骨組織學Mankin’s評分和血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平及軟骨細胞凋亡率降低,表明大鼠軟骨組織損傷得到修復,軟骨細胞的凋亡得到抑制,炎癥反應明顯減輕。此外,軟骨組織HE染色結果也表明軟骨結構受損現象得到改善,細胞腫脹、炎性細胞浸潤現象減少,進一步驗證黃腐酚對軟骨組織的修復作用。

自噬是細胞實現自身代謝和細胞器更新的重要方式,細胞通過自噬降解殘余蛋白和老化細胞器,為其他生理活動提供能量[16]。mTOR蛋白是調控細胞自噬水平的重要通路之一,在調控炎癥反應時,mTOR可作為關鍵靶蛋白,對自噬水平進行調控[17-18]。PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活后,會影響多個下游因子的活化狀態[19],抑制細胞自噬水平,Beclin 1作為自噬水平的負調控因子,高度參與細胞自噬水平的調控過程[20]。在本研究中,模型組大鼠軟骨組織PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平和PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達水平均升高,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平均降低,表明模型組大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活后,Beclin 1的表達被抑制,細胞自噬水平下降,軟骨細胞凋亡率升高,引起軟骨損傷。與模型組比較,黃腐酚各劑量組和西藥組大鼠軟骨組織PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平和PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達水平降低,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平升高,可見黃腐酚能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路、提高細胞自噬水平、抑制軟骨細胞凋亡,對大鼠軟骨損傷有積極影響。

綜上所述,黃腐酚能夠提高KOA大鼠細胞自噬水平、減輕炎癥反應、抑制軟骨細胞凋亡,可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路發揮作用的,可為臨床治療KOA提供實驗依據。