環孢菌素A眼用納米粒溫敏凝膠的制備及質量評價

彭靜雨,梁 雪,周四元,成 穎

空軍軍醫大學藥學系藥劑學與藥事管理學教研室,西安 710032

干眼癥又稱角膜干燥癥,是常見的眼部疾病。由于電子產品的過度使用、角膜接觸鏡的濫用等,干眼癥在我國的發病率呈逐年上升的趨勢,并且發病年齡有降低的趨勢[1-2]。干眼癥的臨床表現為由淚液分泌不足或者淚液的流體力學性質改變而引起的眼睛干澀、發癢、酸脹,嚴重時導致角膜渾濁甚至失明[3]。炎癥是干眼癥的主要發病機制[4-5],環孢菌素A(cyclosporine A,CsA)能有效抑制炎癥因子在眼部組織的浸潤,同時提高抗炎細胞因子的釋放水平,進而增加淚液的分泌,是臨床治療重度干眼癥的首選藥物[6]。但CsA的相對分子質量大,且由于其具有較強的親脂性,眼部直接給藥,藥物與淚液的相容性差,故難以在眼部滯留,影響其發揮治療作用[7-8]。

納米技術是改善難溶性藥物溶解性、穩定性和生物利用度的制劑新技術[9]。通過制備納米粒能增加難溶性藥物的飽和溶解度,加快其溶出速度,繼而可以將其制備成適合多種給藥途徑的藥物制劑。溫敏凝膠能根據溫度變化發生物理狀態的改變。將眼用制劑設計為溫敏凝膠,能滿足藥物在使用前為液體(具備良好的流動性)、眼部給藥后迅速膠凝化(延長藥物在眼球表面的滯留時間)的要求[10]。將納米制劑與溫敏凝膠給藥系統結合,制備的CsA納米粒眼用溫敏凝膠能延長藥物的作用時間,減小對眼部的刺激,提高生物利用度,更加符合臨床需求。

本研究先制備CsA納米粒,再以泊洛沙姆407(poloxamer 407,F127)、泊洛沙姆188(poloxamer 188,P188)和殼聚糖作為基質制備溫敏凝膠,包裹CsA納米粒。用中心點復合設計響應面法篩選最優的凝膠處方,并對制得的CsA眼用納米粒溫敏凝膠的釋藥行為及釋藥機制進行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

精密水銀溫度計、恒溫水浴鍋、HMS-18型磁力攪拌器均購自上海泰坦科技股份有限公司;AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);JNB10型高壓均質機(廣州聚能生物科技有限公司);水浴恒溫振蕩器(蘇州培英實驗設備有限公司);高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司);納米粒度電位儀(英國馬爾文儀器有限公司);透射電子顯微鏡(日本日立公司);低溫恒溫冰箱(青島海爾股份有限公司);高速冷凍型微量離心機(美國賽洛捷克公司);超純水機(重慶摩爾水處理設備有限公司)。

1.2 試藥

環孢菌素A(cyclosporine A,CsA,質量分數為98%,上海源葉生物科技有限公司);泊洛沙姆407(poloxamer 407,F127)、泊洛沙姆188(poloxamer 188,P188)、殼聚糖均購自德國巴斯夫公司;丙酮(天津市富宇精細化工有限公司);乙腈(賽默飛世爾科技有限公司);無水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司);氯化鈉、氯化鉀、二水氯化鈣、碳酸氫鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 CsA納米粒溫敏凝膠的制備

2.1.1CsA納米粒的制備 用納米沉淀-高壓均質法制備CsA納米粒溶液。稱取20 mg CsA溶于1 mL丙酮作為有機相;稱取100 mg F127溶于10 mL去離子水作為水相。在室溫條件下邊攪拌邊將有機相勻速滴入水相中。在通風櫥中自然攪拌揮發丙酮,收集溶液。所得溶液用高壓均質機進行粒徑均化處理(設置條件:1 500 bar,均質10次,4 ℃),獲得泛乳光的納米粒溶液,見圖1。如圖1所示,CsA納米粒的粒徑為(220±10) nm;Zeta電位為(-10±1) mV。納米粒的透射電鏡圖見圖2。由圖2可見,納米粒分散均勻。用超高效液相色譜儀檢測CsA納米粒溶液中藥物的質量濃度,將CsA納米粒溶液中藥物的質量濃度稀釋至1 mg·mL-1。

注:A.CsA納米粒粒徑圖;B.CsA納米粒電位圖。

圖2 CsA納米粒的透射電鏡圖

2.1.2CsA眼用納米粒溫敏凝膠的制備 用低溫溶脹法制備CsA眼用納米粒溫敏凝膠。按優化處方投料比分別稱取F127、P188、殼聚糖,加入相應體積的CsA納米粒溶液中。將樣品靜置于4 ℃冰箱中(≥48 h),待所有凝膠基質充分溶脹,即得CsA眼用納米粒溫敏凝膠溶液。

2.2 膠凝溫度的測定

2.2.1人工淚液的配制 稱取氯化鈉6.78 g、氯化鉀1.38 g、二水氯化鈣0.08 g、碳酸氫鈉2.18 g,用去離子水溶解并定容至1 000 mL,振蕩至溶液澄清無顆粒[11],即得。

2.2.2原始膠凝溫度T1的測定 將精密溫度計插入制備好的CsA納米粒溫敏凝膠溶液中,一并置于恒溫水浴鍋(起始溫度為20 ℃,設定溫度為50 ℃)中緩慢升溫。將試管傾斜90°觀察液體流動情況,以玻璃棒攪動難易程度確定膠凝溫度。

將試管傾斜90°,當藥液呈半固體凝膠狀無流動、用玻璃棒攪動藥液有輕微阻力感時,記錄溫度計讀數。取出試管自然冷卻至藥液恢復呈液體狀,再次記錄溫度計讀數。平行測量3次,計算3次的平均值,即為膠凝溫度。

2.2.3用模擬人工淚液稀釋后膠凝溫度T2的測定 將CsA眼用納米粒溫敏凝膠溶液與人工淚液按照40∶7的體積比混勻[12],按照2.2.2項下的方法測定用模擬人工淚液稀釋后的膠凝溫度T2。

2.3 處方優化

2.3.1實驗設計 采用軟件Design Expert 13以中心點復合響應面法設計3因素5水平實驗[13]。選取對CsA眼用納米粒溫敏凝膠的膠凝溫度影響顯著的3個因素,即F127、P188、殼聚糖的質量占比為自變量。根據預實驗結果,在滿足實驗目的前提下,確定自變量的取值區間依次為18%～28%、0～8%、1%～4%。根據軟件內置代碼±α(α=1.68),±1,0設計5水平實驗,見表1[14-15]。膠凝溫度為測量指標,具體處方和結果見表2。

表1 3因素5水平實驗設計

表2 中心點復合響應面法實驗設計結果 (n=3)

2.3.2模型擬合 用Design Expert 13軟件,以實驗變量為自變量,以膠凝溫度為因變量,分析自變量與因變量的關系,擬合方程建立線性回歸。其中x1表示F127的質量占比,x2表示P188的質量占比,x3表示殼聚糖的質量占比。

T1=25.41-5.26x1+3.78x2-1.52x3-1.3x1x2+0.254 2x1x3+0.195 8x2x3+1.29x12+0.331 1x22-0.042 4x32

T2=33.54-7.62x1+4.06x2-1.09x3+0.566 7x1x2+1.04x1x3+0.058 3x2x3+1.56x12-0.009 4x22-0.233 3x32

膠凝溫度模型方差分析結果見表3。由表3可知,R2>0.9并且信噪比>4,表明T1和T2模型的擬合度好。P<0.01且F值顯著,表明模型穩定性好。失擬誤差顯著(>0.1)表明擬合的模型效果好。以二次多項式方程為數學模型繪制三維響應面圖,見圖3。由圖3可見,當殼聚糖質量占比為定量時,F127和P188的質量占比對膠凝溫度的影響較大。經模擬淚液稀釋后,各實驗組的膠凝溫度均有不同程度的升高,見圖4。加入淚液后,殼聚糖的質量占比對膠凝溫度的影響增大。

表3 膠凝溫度模型方差分析

圖3 F127、P188、殼聚糖質量比對T1的三維響應面圖

圖4 F127、P188、殼聚糖質量比對T2的三維響應面圖

2.3.3響應面優化與工藝驗證 構建模型的最終目的是設計符合眼部給藥要求的凝膠制劑,滿足凝膠制劑在儲存條件下具有良好的流動性、在眼部給藥后相變為半固體狀態、形成藥物儲庫的要求。有文獻報道,將T1控制在25～30 ℃、T2控制在30～35 ℃是眼用凝膠制劑的理想狀態。設置25 ℃≤T1≤30 ℃、30 ℃≤T2≤35 ℃的目標范圍,軟件給出的100個符合條件的凝膠處方,從中任意挑選4個處方,按照2.1.2項下的方法制備凝膠,驗證該模型的可靠性,見表4。如表4所示,4個凝膠處方實測值與預測值的偏差在可接受的范圍內(±5%)。其中處方4的制劑產品符合理想眼用凝膠制劑的標準。最終確定F127、P188與殼聚糖的質量比為22.108∶1.754∶1.734。

表4 凝膠處方驗證 (n=4)

2.4 體外評價

2.4.1凝膠溶蝕考察 稱取適量CsA眼用納米粒溫敏凝膠,置于西林瓶中預先膠凝化,平行制備3份。將人工淚液作為溶蝕介質,沿瓶壁加入提前保溫的人工淚液,再一并置于恒溫水浴振蕩器中振蕩溶蝕,每隔30 min將溶蝕介質全部取出,稱取西林瓶的質量,再加入新鮮人工淚液3 mL繼續振蕩溶蝕。結果見圖5。由圖5可知,CsA眼用納米粒溫敏凝膠的時間-凝膠溶蝕率曲線呈線性關系,7 h內CsA眼用納米粒溫敏凝膠的體外溶蝕率達75%。

圖5 CsA眼用納米粒溫敏凝膠體外溶蝕曲線

2.4.2凝膠釋藥行為及機制研究 稱取適量CsA眼用納米粒溫敏凝膠預先膠凝化,平行制備3份。為滿足漏槽條件,以含有體積分數10%乙醇的人工淚液作為釋藥介質。

沿壁加入提前保溫的人工淚液,再一并置于恒溫水浴振蕩器中振蕩,分別在0.5、1、2、4、8、20、24 h取釋放介質,處理后注入超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)系統進行分析。色譜條件:色譜柱為ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相為乙腈-水(85∶15);檢測波長為210 nm;柱溫為50 ℃;流速為0.2 mL·min-1;進樣量為5 μL。釋藥結果見圖6,在滿足漏槽條件的前提下,24 h凝膠累積釋放度能達到90%以上,CsA眼用納米粒溫敏凝膠具有緩釋的作用。

圖6 CsA眼用納米粒溫敏凝膠的體外釋藥曲線

為了闡明CsA眼用納米粒溫敏凝膠的釋藥機制,用DD.solver.1.0軟件對釋藥曲線進行擬合,經過對相關系數進行比較,確定CsA眼用納米粒溫敏凝膠釋藥曲線滿足Peppas-Sahlin模型(R2=0.998 8),釋藥方程為F=11.307t0.877-0.352t1.754,見圖7。表明藥物的釋放機制為非Fick擴散,釋藥是擴散與溶蝕并存的過程[16-17]。

圖7 釋藥曲線擬合模型——Peppas-Sahlin模型

3 討論

CsA水溶性差,直接制備CsA溫敏凝膠,藥物的含量極低,為了解決藥物溶解性的問題,實驗采用納米化技術提高CsA在溶液中的溶解度。溫敏凝膠的三維網狀結構使藥物納米粒嵌入凝膠的網狀結構中,從而達到緩釋的效果[18]。二者結合滿足理想眼部給藥系統的條件。

F127和P188是常用的凝膠基質,對黏膜的刺激性小且安全性高[19]。殼聚糖的生物相容性好、眼部耐受性高。此外,研究發現殼聚糖能夠作為藥物穿過角膜屏障的促進劑,能延長藥物在眼球表面的停留時間,增加藥物在眼內的滲透性,提高藥物的生物利用度[20-21]。本研究結果顯示,F127與殼聚糖的質量比增大會使膠凝的溫度降低,而P188則相反。因此,調整3種輔料的質量比能改變CsA眼用納米粒溫敏凝膠的溫度,制備出理想的能夠在眼部溫度下成功膠凝的溫敏凝膠。本實驗研究3個變量對凝膠溫度的影響,不同于單因素實驗中自變量與因變量一對一的關系,多因素之間由于存在交互作用,變量與膠凝溫度的關系無法用二維關系表示,因此需要運用專業軟件Design Expert 13設計三維響應面構建凝膠處方優化模型。

溫敏凝膠溶蝕速度受多個因素影響,包括凝膠溶蝕面積、振蕩頻率和溶蝕溫度等。總體而言,在滿足漏槽條件的情況下,凝膠溶蝕量與時間呈一次線性關系。溫敏凝膠的釋藥行為呈現出緩釋的效果,釋藥機制研究結果顯示,凝膠釋藥是溶蝕和擴散并存的過程。

綜上所述,CsA眼用納米粒溫敏凝膠具有較理想的凝膠溫度和緩釋作用。后續還需要在細胞和動物水平對該制劑的安全性和有效性進行進一步評價。