EGFR m6A修飾參與肺動脈高壓發病機制的研究進展

趙帥帥,顏 諾,李曉貴,吳起才,周學亮

(南昌大學第一附屬醫院心臟大血管外科,南昌 330006)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是由肺動脈壓力進行性升高所引起的一系列嚴重的心血管疾病,其發病率在全球范圍內逐年上升[1-2]。PH的發病機制與遺傳、環境和生物學等多個因素有關,然而,PH的病因尚未被完全闡明。因此,探索PH發病的細胞基礎和分子機制,探索新的治療靶點對其臨床治療具有重大的意義。隨著RNA修飾領域的研究不斷取得進展,代謝和表觀遺傳學之間的串擾在基因表達、細胞增殖和分化中起的關鍵作用逐漸清晰。特別是N6-甲基腺苷(m6A)修飾因其在調控基因表達和細胞命運決定過程中發揮的重要作用受到了人們的廣泛關注。RNA m6A修飾可能與PH的形成有關,并且m6A結合蛋白YTHDF2在該過程中發揮了重要的調控作用。為了更好地認識這些新發現,本綜述將對m6A修飾、YTHDF2和EGFR在PH發病機制中的作用進行系統性的介紹和探討。

1 PH的研究現狀

PH的主要組織病理學特征是血管壁的重塑,包括內膜增生、中膜肥厚、外膜纖維化和細胞外基質沉積,這些變化綜合導致了肺動脈管腔進行性狹窄、閉塞,肺動脈內皮細胞(pulmonary arterial endothelial cells,PAECs)、肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)在該病理過程中具有重要作用,PASMCs的過度增殖是肺動脈重構的主要特征[3]。

PH的發病機制復雜,涉及多種生物學過程,包括血管活性分子分泌、離子通道調節、凋亡抵抗、氧化應激反應、炎癥和免疫失調等[4]。目前正在被研究的參與PH疾病發生的信號通路包括MAPK/MK2通路、Hippo-YAP/PI3K/AKT通路、NF-κB/TNF-α通路、Src/EGFR/NOX2通路、AK4/HIF-1α通路、EGFR/ERK通路、SEDT2/METTL14通路、METTL3/YTHDF2/PTEN通路和Notch通路等[3-11]。

PH的治療方案包括一般治療、藥物治療和手術治療。其中,一般治療主要指活動和康復指導,抗凝藥物、利尿劑和心血管活性藥物治療,氧氣治療,改善貧血和補鐵治療以及社會心理支持等。藥物治療則包括鈣通道阻滯劑(calcium channel blockers,CCB)、內皮素受體拮抗劑(endothelin receptor antagonists,ERA)、5-磷酸二酯酶抑制劑、鳥苷酸環化酶激動劑(guanylate cyclase stimulators,sGC)、前列環素類似物和前列環素受體激動劑[12]。以上藥物雖然可以改善PH患者的癥狀,但其長期預后仍然較差,病死率較高。因此,新藥物和治療方案的研發成為PH研究中的重點領域。

2 EGFR在PH中的作用

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種酪氨酸激酶受體,由細胞外配體結構域、跨膜結構域和細胞內酪氨酸激酶受體結構域組成,對包括細胞增殖和血管生成在內的多種生物過程起重要調節作用[6]。有研究[9]表明人肺微血管內皮細胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,hPMVECs)增殖依賴于EGFR的激活。增殖的PMVECs釋放多種生長因子和趨化因子,包括精氨酸酶-2(arginase-2,Arg-2)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、趨化因子(C-X-C chemokine ligand12,CXCL12)、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)、巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和內皮素-1(endothelin-1,ET-1)[13],這些因子共同促進PASMCs增殖和肺血管重構[14]。另有研究[15]證明來自PH患者的PASMCs比來自健康人的對生長因子更敏感,EGFR過度表達是導致PH患者PASMCs過度增殖的重要原因。同時,免疫組織化學實驗檢測到在缺氧和野百合堿 (monocrotaline,MCT) 誘導的PH模型中的肺血管壁EGFR表達增加,主要分布在PASMCs中。

有研究表明[16]EGFR促進泡沫細胞轉化,并加速以平滑肌細胞和巨噬細胞積累為特征的動脈粥樣硬化病變。有研究者[17]證實缺氧導致了核蛋白亞細胞分布的改變,顯著促進了EGFR信號的激活,EGFR的磷酸化修飾增強了血管細胞對Ca2+的敏感性,導致血管收縮作用增強以及肺血管重構發生發展[18]。而注射EGFR抑制劑可以改善MCT誘導的PH大鼠的肺動脈重構[17-18]。上述研究結果表明EGFR的異常激活是PASMCs、PMVECs增殖、遷移和存活的重要原因,因此,EGFR信號通路的正常轉導對肺血管功能的維持十分重要,也是治療PH的潛在靶點。

EGFR可以激活下游細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)[19],ERK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成員,ERK/MAPK信號通路已被證明對多種細胞的生存和增殖過程至關重要。缺氧處理誘導EGFR激活導致ERK的磷酸化,從而促進細胞增殖[9]。同時磷酸化的ERK可以激活缺氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)[20],HIF-1是一種由α亞基和β亞基組成的異二聚體轉錄因子。激活后的HIF-1α亞基積累并轉移到細胞核,與HIF-1β結合形成異源二聚體,激活并轉錄與能量代謝、細胞增殖、凋亡和細胞外基質重組有關的基因[21]。HIF-1的過表達也將促進PASMCs增殖和肺血管重構[22]。綜上所述,EGFR激活是PASMCs增殖和肺血管重構過程中的關鍵信號。

3 m6A修飾及其結合蛋白調節mRNA的穩定性

RNA修飾包括甲基化、磷酸化、乙?；然瘜W修飾,N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核生物mRNA中最豐富的堿基修飾,mRNA的m6A修飾與多種細胞過程密切相關[23]。m6A主要分布于mRNA的開放閱讀框(ORF)[24-25]、3′-非翻譯區(UTRs)和終止密碼子附近[26]。mRNA甲基化修飾受甲基轉移酶、去甲基化酶以及甲基化結合蛋白的動態調控以維持基因的正常表達,其中所涉及的調控因子有:甲基轉移酶復合物METTL3 /METTL14/WTAP,其中METTL3是核心酶,METTL14在體內與METTL3形成穩定的異二聚體,WTAP可以與METTL3和METTL14形成復合物重新組裝成泛甲基轉移酶復合物,共同催化m6A甲基化。去甲基化酶ALKBH5和FTO負責催化去甲基化作用,m6A結合蛋白識別mRNA的目標區域并與之結合以實現相應的功能(詳見表1)[27]。

表1 m6A調節因子在RNA代謝中的功能

m6A結合蛋白的YTH結構域由134個氨基酸組成[28],YTH結構域蛋白包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2,YTHDC蛋白通常局限于細胞核,而YTHDF蛋白主要存在于細胞質中,已有證據[29]表明它們調控mRNA的加工、翻譯和降解過程。YTHDF1通過與翻譯起始因子和核糖體相互作用來增強翻譯;YTHDF2通過與靶mRNA結合,促進其降解;YTHDF3與YTHDF1和YTHDF2相互作用[27],協助調控mRNA的翻譯和降解。m6A結合蛋白相互作用,共同控制細胞內RNA的穩定、剪切和翻譯,從而影響基因表達調節和相關疾病的發生。m6A的失調可導致腫瘤、免疫系統疾病、心血管疾病和代謝性疾病的發生和發展,如何維持上述分子表達和功能水平處于穩態,是預防血管異常增生和血壓升高的關鍵。

4 m6A結合蛋白YTHDF2對EGFR mRNA的調控

m6A修飾在細胞中的作用是通過多種機制介導的,通過影響mRNA的轉運、降解、翻譯和代謝,參與多種病理生理過程。在干細胞中,m6A修飾通過改變mRNA的穩定性,調節干細胞的分化[25]。已有研究[3,10]證明m6A修飾影響PH病理生理過程中多個特定基因的表達水平,METTL3、METTL14參與調節PASMCs增殖和肺血管重構。在哺乳動物YTH蛋白家族中,YTHDF2已被證明通過CCR4-NOT復合物的去烯基化[30],或HRSP12-RNaseP/MRP7-9復合物來破壞mRNA穩定性[31],從而影響細胞的自我更新和分化過程。在細胞質內,YTHDF2在正常和應激條件下促進了m6A依賴的mRNA的降解[32]。

近期研究[28-30]表明m6A及其結合蛋白YTHDF2均參與PH的發生發展,并影響EGFR mRNA水平,進而影響疾病進展。值得注意的是,m6A結合蛋白YTHDF2可以選擇性地識別和結合m6A修飾的RNA,并對相關基因的mRNA轉錄和降解發揮關鍵作用。在YTHDF2的干預下,EGFR mRNA的轉錄水平和穩定性發生了變化,這影響了PH的發病過程。LI等[16]的研究也表明m6A介導了EGFR mRNA降解,從而導致血管內皮細胞功能障礙。另有一項肝癌研究[33]的數據也顯示YTHDF2通過結合EGFR 3′-UTR的m6A修飾位點,加速EGFR的降解來抑制ERK/MAPK通路和細胞增殖,影響肝癌的進展。

研究已經表明在PH模型的PASMCs、PMVECs中EGFR過表達[9,15],EGFR mRNA的穩定性受m6A級聯反應的調控。筆者的研究團隊據此推測,EGFR mRNA在PMVECs的胞質中生成并獲得m6A修飾,在缺氧環境中YTHDF2表達上調,影響EGFR mRNA的穩定性,而EGFR磷酸化后可以激活ERK/MAPK通路,誘使HIF-1α轉移到細胞核與HIF-1β結合形成異源二聚體,通過旁分泌方式分泌細胞因子促進PAECs增殖,并促使PAECs分泌ET-1,ET-1被PASMCs攝入并內化后,通過調控其細胞內Ca2+濃度和下游靶基因mRNA和蛋白的表達,調控PASMCs的增殖、凋亡等細胞過程,參與PH的病理變化(機制流程示意見圖1)。

圖1 YTHDF2通過調控EGFR mRNA 影響PH發展的機制假設

5 總結與展望

PH是一種進行性加重的心血管疾病,嚴重影響患者的生活質量,目前無法根治。RNA的m6A修飾參與了PH發病機制的調控,YTHDF2作為m6A“讀取器”蛋白家族的主要成員之一,通過調控EGFR mRNA的穩定性和轉錄水平來影響PH的發生和發展,因此,探討m6A結合蛋白YTHDF2對EGFR mRNA的調控機制對PH治療有著重要的意義。

PASMCs和PAECs的過度增殖和凋亡抵抗直接導致了PH患者的肺血管重構,EGFR在其中的作用不可忽視。YTHDF2/EGFR參與調控細胞凋亡、增殖、遷移等過程,很可能通過與ERK/MAPK、HIF-1α、ET-1、Ca2+等因子相互作用,構成了一個多通路、多層次的復雜調控網絡,介導了肺血管重構的發生。關于EGFR在各種疾病中作用的研究僅揭開了其機制的冰山一角,而對PH中EGFR角色的研究才剛剛開始。