甘露消毒丹及其拆方對肺炎支原體干預的NR8383 細胞炎癥因子表達的影響

鄭 豪 張葆青 周 旭

1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東濟南 250355；2.山東中醫藥大學附屬醫院中醫兒科，山東濟南 250014

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染是引起兒童社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的重要原因，該病近年呈現上升趨勢，嚴重威脅患兒的身心健康[1-3]。目前西醫治療該病多采用抗生素、免疫抑制劑和對癥治療等措施，但均有一定的缺陷和副作用[4]，因此繼續尋找安全有效的MP肺炎（Mycoplasmal pneumoniae pneumonia，MPP）治療藥物尤為必要。甘露消毒丹由葉天士所創，后由王孟英收入《溫熱經緯》，專為濕溫時疫而設，具有較強的抗菌和抗病毒作用[5]。網絡藥理研究發現，方中槲皮素、木犀草素等多種化學成分能有效作用于腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10 等MPP 核心靶點[6]。張葆青教授化裁本方治療兒童MPP 濕熱閉肺證，并根據多年經驗舍棄腎毒性較強的木通，用清熱化痰力強的浙貝母代替川貝母，臨床效果頗驗，但關于本方治療MPP 的實驗依據相對欠缺，故本研究探討甘露消毒丹含藥血清對MP 感染的大鼠肺泡巨噬細胞（NR8383）炎癥因子表達的調控作用，并將其分解為拆方1（味辛性熱的陽性藥物）和拆方2（味苦性寒的陰性藥物），觀察兩類藥物對炎癥因子的調控有無差異，以期從中醫陰陽的角度為MPP 的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取8 周齡SPF 級雌性Wistar 大鼠，體重（200±10）g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證編號：SCXK（京）2016-0006；合格證號：11001121-1104764715]，飼養于山東中醫藥大學（以下簡稱“我校”）動物中心，期間給予常規飲食、自然光線、避免噪聲干擾、定時更換墊料等措施，適應性喂養1 周，觀察大鼠飲食、二便、行為等無明顯異常即可進行，實驗動物倫理由山東中醫藥大學動物福利倫理審查委員會受理（2021-60）。

1.2 細胞株及菌株

NR8383 細胞株購買于中國醫學科學院基礎醫學研究所；MP 菌株（ATCC-15531）購買于上海寶錄生物科技有限公司。

1.3 實驗藥物

中藥由山東中醫藥大學附屬醫院門診中草藥房提供。甘露消毒丹組成：藿香12 g、茵陳15 g、黃芩9 g、連翹9 g、石菖蒲12 g、豆蔻9 g、浙貝9 g、薄荷6 g、射干9 g、滑石15 g。拆方1 組成：藿香12 g、石菖蒲12 g、豆蔻9 g、薄荷6 g。拆方2 組成：茵陳15 g、黃芩9 g、連翹9 g、浙貝9 g、射干9 g、滑石15 g。阿奇霉素膠囊（北京四環制藥有限公司，21051751，0.25 g×6 粒）。

1.4 主要儀器與試劑

生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，BHC-1300ⅡA2）、離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司，TDZ5-WS）、低溫高速離心機[美瑞克儀器（上海）有限公司，MH-1650R]、二氧化碳細胞培養箱（Thermo，HERAcell150i）、恒溫恒濕培養箱（上海躍進醫療器械有限公司，LRHS-150-Ⅲ）、低溫冰箱（合肥美菱股份有限公司，BCD-200MCX）、熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS，CKX41）、酶標儀（北京普朗新技術有限公司，DNM-9602）、實時熒光定量PCR 儀（Roche，Light Cycle）、顯影儀（GE 醫療，Amersham Imager 600）。

F-12K 培養基和進口胎牛血清（中國醫學科學院基礎醫學研究所），支原體肉湯培養基（青島海博生物技術有限公司，HB7025-2），注射用青霉素鈉（山東魯抗醫藥股份有限公司，43210512），增強型細胞活力檢測試劑盒（CCK-8，Elabsciense，E-CK-A362），大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10 酶聯免疫吸附試驗試劑盒（El-absciense，E-EL-R2856c、E-EL-R0012c、E-EL-R 0016c），SPARKeasyImprovedTissue/CellRNAKit（Spark-Jade，AC0202），SPARKscriptⅡRT Plus Kit（SparkJade，AG0304），2× SYBR Green qPCR Mix（Spark Jade，AH0104），PAGE 凝膠快速制備試劑盒（Epizyme，PG112），β-Actin Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，4970），Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）Polyclonal Antibody（Thermo Fisher，48-2300），MyD88 Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，4283），核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）-p50 Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，13586），Anti-rabbit IgG HRPlinked Antibody（Cell Signaling Technology，7074）。

1.5 研究方法

1.5.1 藥物制備 各組中藥分批熬制，加水沒過藥材（滑石先下包煎，藿香、豆蔻、薄荷后下），大火煮沸后轉小火煮30 min，濾出藥液，重復3 次，藥液合并后低溫冷凝回流濃縮至2 g/ml 的生藥濃縮液，分裝后于-20℃冷凍保存。阿奇霉素膠囊用生理鹽水配制成5 mg/ml 的混懸液。

1.5.2 含藥血清制備 將35 只大鼠按隨機數字表法分為空白血清組、甘露消毒丹血清組、阿奇霉素血清組及拆方1、2 血清組，每組7 只。根據計算公式換算大鼠的給藥標準，以6 歲兒童（體重20 kg）的用量為標準，大鼠劑量=（藥物總量/兒童體重）×比例系數6.3[7]，阿奇霉素血清組，拆方1、2 血清組，甘露消毒丹血清組的給藥劑量分別為0.063、12.3、20.8、33 g/（kg·d），空白血清組予2ml/d 的生理鹽水，五組均灌胃給藥，1次/d，連續給藥1 周，末次給藥2 h 后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 ml/kg），腹主動脈取血，離心（轉速為3 000 r/min，離心半徑為170 mm，離心時間為15 min）分離血清，水浴滅活（56℃下30～40 min），無菌條件下用0.22 μm 過濾器過濾，分裝至2 ml 凍存管并做好標記，-80℃凍存備用。

1.5.3 NR8383 細胞培養 細胞培養于含15%滅活胎牛血清的F-12K 培養基中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，每隔2～3 d 換液1 次，待細胞在T25 瓶中匯合至80%時按1∶2 的比例傳代。

1.5.4 細胞活力檢測96 孔板采用5×105個/ml 細胞鋪板，100 μl/孔，加入100 μl 培養基，孵育過夜后分別加入5 種血清5 μl，無血清處理的細胞加入5 μl 培養基，孵育24 h。孵育結束后，所有孔加10 μl CCK-8 溶液，2 h 后采用酶標儀測量450 nm 處的吸光度，每孔測量3 次取平均值，每種處理設置3 個復孔，計算細胞存活率[7]。

1.5.5 MP 培養MP 培養于含20%胎牛血清和800 U/ml青霉素的支原體肉湯培養基中，置于37℃培養箱中恒溫培養，待菌液由紅色變為黃色時按1∶10 的比例傳代。

1.5.6 MP 濃度測定96 孔板設10 個組，每組3 復孔平行操作，向所有孔中加入180 μl MP 肉湯培養基，取20 μl 待傳代的菌液加入第1 孔，混勻后從第1 孔吸取20 μl 菌液加入第2 孔，以此類推，依次按1∶10 的比例遞減稀釋，并設陰性和陽性對照，所有孔加3滴石蠟油防止蒸發，蓋好板蓋，做好標記，37℃恒溫孵育，每日觀察，直至顏色不再發生改變，取106～107CCU/ml菌液備用[8]。

1.5.7 細胞分組及給藥 將NR8383 細胞設置對照組、模型組、甘露消毒丹組、阿奇霉素組及拆方1、2 組。調整細胞濃度為1.2×106個/ml，取6 個T25 瓶，每瓶加入5 ml 孵育過夜。取30 ml 濃度為106～107CCU/ml的MP 菌液離心（溫度為20℃，離心條件為12 000 g，離心時間為20 min），用5 ml 細胞培養液重懸，平均加入模型組、甘露消毒丹組、阿奇霉素組及拆方1、拆方2 組中，每組1 ml，對照組加1 ml 不含MP 的細胞培養液，孵育4 h。然后分別向甘露消毒丹組、阿奇霉素組及拆方1、2 組加300 μl 對應含藥血清，對照組和模型組加300 μl 空白血清，孵育24 h 后收集細胞及上清液，按試劑盒要求保存備測。

1.5.8 qRT-PCR 根據試劑盒要求提取細胞RNA 后，將其逆轉為cDNA，反應體系為2×SYBR qPCR Mix 5.0 μl，cDNA 1.0 μl，正、反向引物各0.2 μl，RNase Free H2O 3.6 μl。用2-ΔΔCt法計算基因相對表達水平。引物序列見表1，ACTB 為內參基因。

表1 引物序列

1.5.9 蛋白質印跡法 提取各組細胞蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，SDS-PAGE 法分離蛋白后轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，兔β-actin、TLR4、MyD88、NF-κB-p50 抗體（稀釋倍數為1∶1 000、1∶50、1∶1 000、1∶1 000）室溫孵育2 h，HRP 標記的山羊抗兔IgG（稀釋倍數為1∶2 000）室溫孵育1 h，顯色成像獲得蛋白條帶，Image J 軟件計算灰度值。

1.5.10 酶聯免疫吸附試驗檢測各組細胞上清液炎癥因子的表達 分別檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10 的表達，操作按試劑盒說明書進行。采用Origin 9.64 進行促炎性細胞因子的濃度換算。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組比較采用t 檢驗；多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 含藥血清對NR8383 細胞活力的影響

各血清處理的細胞存活率均低于無處理的細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。各血清處理細胞存活率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 不同血清處理細胞與未處理細胞存活率比較（n=3）

2.2 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 mRNA 表達比較

模型組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 mRNA 表達高于對照組，甘露消毒丹組、拆方2 組TLR4、MyD88、NFκB-p50 mRNA 表達低于模型組，拆方1 組MyD88 mRNA 表達低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。甘露消毒丹組TLR4、MyD88mRNA 表達低于拆方1組，NF-κB-p50 mRNA 表達高于拆方2 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 mRNA 表達比較（n=3）

2.3 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平比較

模型組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平高于對照組（P＜0.05）。甘露消毒丹組、拆方2 組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平低于模型組，拆方1 組TLR4 蛋白水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。甘露消毒丹組TLR4、MyD88、NF-κB-p50蛋白水平低于拆方1 組，TLR4 蛋白水平高于拆方2組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3～4。

圖3 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白表達條帶圖

圖4 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平比較（n=3）

2.4 五組細胞上清液炎癥因子水平比較

甘露消毒丹組、拆方2 組TNF-α、IL-1β 水平低于模型組，拆方1 組IL-1β 水平低于模型組，拆方2組IL-10 低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。甘露消毒丹組TNF-α、IL-1β、IL-10 水平均低于拆方1 組，TNF-α、IL-1β 水平高于拆方2 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 五組細胞上清液炎癥因子水平比較（n=3）

3 討論

兒童MPP 屬于中醫“肺炎喘嗽”“馬脾風”“風溫時疫”等范疇，多因小兒衛外不固、復感外邪所致[9-10]。MP感染與濕熱因素關系密切[11]，夏秋為MP 感染流行的季節，正值濕熱邪氣當令[12]，小兒為純陽之體，外邪侵襲，易入里化熱，內外合邪，發為本病[13]，故以清利濕熱為治療大法。甘露消毒丹主治濕熱并重之濕溫時疫，恰合兒童MPP 濕熱證的病因病機，方中茵陳、黃芩、滑石清利濕熱；豆蔻、石菖蒲、藿香化濕和中；連翹、薄荷、射干清熱解毒，浙貝母化痰止咳、清熱散結，相較于川貝母少甘潤而多苦寒，更適合濕熱郁結之咳嗽，諸藥合用共奏利濕化濁、清熱解毒之功。

免疫炎癥是MPP 的自我保護機制之一，但過度炎癥也是導致病情惡化的重要原因[14]。TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路與炎癥有關，其激活后過度產生的TNF-α、IL-1β 等促炎性細胞因子通過與靶細胞的特異性受體結合而加重炎癥反應，是造成患兒肺部損傷的重要原因[15-18]。研究發現，由MP 感染引起的肺炎患兒血清中TNF-α 的表達明顯上升[19-21]；MP 產生的CARDS TX 可催化腺苷二磷酸核糖基化激活NLRP3炎癥小體，誘導IL-1β 的產生[22]，其表達與病情嚴重程度密切相關[23]。IL-10 是一種負性調節因子[24]，其可抑制過度炎癥損害宿主本身[25]，研究顯示，在MPP 患兒急性期IL-10 的表達相對較低，經治療后其表達上升[26]，說明其參與了疾病恢復期的炎癥消退和組織修復。但也有研究指出，重癥MPP[27]和難治性MPP[28]患兒血清中IL-10 的表達與病情的嚴重程度呈正相關，這可能與其調控免疫的功能相關，在免疫紊亂時其表達隨著炎癥程度的加重而上升，從而限制過度炎癥帶來的組織損害，因此IL-10 可能是兒童MPP 嚴重程度的重要預測指標。

甘露消毒丹由陽性藥物和陰性藥物組成，但兩種藥物對炎癥因子的表達調控可能存在差異，其作用方向也可能不同。本研究結果顯示，甘露消毒丹及其拆方含藥血清均能不同程度地下調MP 感染的NR8383細胞中TNF-α、IL-1β 水平，其機制可能與調控TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關。中藥三組綜合來看拆方2組效果最優，甘露消毒丹組次之，拆方1 組下調作用較低，提示陰性藥物對促炎性細胞因子的下調作用較明顯，陽性藥物效果欠佳。從中醫角度分析其原因可能是炎癥多以紅、腫、熱、痛為主要表現，其為陽證，陰性藥物與之相克，故其效佳。正如《景景室醫稿雜存·以藥治病關乎氣化說》記載：“病也者，不過寒熱有所偏頗……以寒氣之藥化病氣之熱，以熱氣之藥化病氣之寒……是藥之所以能治病者。”也體現出中醫“治熱以寒”的診療思維。IL-10 具有較強的免疫調節功能，在本研究中其表達上調可能是為了平衡促炎環境，避免大量促炎性細胞因子損害細胞本身，其表達水平與炎癥程度呈正相關，因此推斷拆方2 組IL-10 表達較低的原因可能是該組含藥血清較大程度地抑制了TNF-α、IL-1β 等促炎性細胞因子的表達，從而間接降低了IL-10 的水平。

總之，本研究初步驗證了甘露消毒丹及其拆方含藥血清對MP 感染的NR8383 細胞炎癥因子表達的影響，但MP 感染后細胞因子的表達調控是一個極其復雜的過程，其表達在體外細胞和體內有很大差異，因此后期仍需在本研究的基礎上進一步闡明甘露消毒丹的作用機制。此外，雖然拆方1 組和拆方2 組含藥血清均能下調促炎性細胞因子的表達，但僅用辛熱藥或苦寒藥治療疾病不符合中醫“謹察陰陽而調之，以平為期”的觀點，容易打破機體“陰平陽秘”的狀態，故其緩解炎癥的機制究竟是調節免疫反應還是破壞免疫平衡有待進一步研究。