血清miR-137、Notch1 表達(dá)與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系

楊 娜 張?jiān)铝?付 燕 溫曉英

河北省保定市第一中心醫(yī)院眼二科，河北保定 071000

糖尿病是常見的慢性疾病，2021 年全球20～79 歲人群糖尿病患病人數(shù)達(dá)5.37 億，我國該年齡段人群糖尿病患病人數(shù)為1.41 億，預(yù)計(jì)到2045 年將增加至1.74 億，疾病負(fù)擔(dān)居世界首位[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致糖尿病患者致盲的主要原因，嚴(yán)重威脅患者生命質(zhì)量[2-3]。持續(xù)高血糖引起的新生血管形成是DR 發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[4]。研究表明，微RNA（micro RNA，miRNA）參與DR 發(fā)生發(fā)展[5]。miR-137 是一種廣泛保守的miRNA，有研究分析DR 患者miRNA 表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-137 是DR 患者異常表達(dá)miRNA 之一[6]。缺口受體1（Notch receptorl,Notch1）是一種細(xì)胞表面受體，能通過與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、細(xì)胞外基質(zhì)分子等相互作用，直接或間接參與新生血管形成過程[7]。目前關(guān)于血清miR-137、Notch1 表達(dá)與DR 的關(guān)系尚缺乏報(bào)道，基于此本研究報(bào)道如下，以期為DR 防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年1 月至2022 年12 月河北省保定市第一中心醫(yī)院收治的147 例2 型糖尿病（type 2 diabetesmellitus，T2DM）患者為T2DM 組，另選取同期52名健康體檢者為對(duì)照組。T2DM 組男79 例，女68 例；年齡28～87 歲，平均（61.83±12.28）歲；體重指數(shù)18.74～33.30 kg/m2，平均（24.94±3.02）kg/m2；病程2～22 年，平均[9.00（6.00，13.00）]年。對(duì)照組男28 例，女24 例；年齡24～82 歲，平均（60.38±11.22）歲；體重指數(shù)19.93～28.62 kg/m2，平均（24.27±1.80）kg/m2。兩組年齡、體重指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整；②T2DM 符合《中國2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型糖尿病；②近3 個(gè)月急慢性感染；③合并造血、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)損害和惡性腫瘤；④年齡＜18 歲；⑤合并甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺等其他內(nèi)分泌疾病；⑥近6 個(gè)月免疫抑制劑、激素使用史；⑦既往眼部疾病、先天性弱視、眼內(nèi)手術(shù)史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（[2021]055）。

1.2 研究方法

1.2.1 血清miR-137、Notch1 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象入院時(shí)空腹靜脈血3 ml，1 500 g 取上層血清，使用Trizol 法提取總RNA，TaKaRa RNA PCR Kit 試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：RR024A）合成cDNA。參考試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，貨號(hào)：DRR041A）說明書進(jìn)行擴(kuò)增，miR-137 以U6 為內(nèi)參校正，Notch1以GAPDH 為內(nèi)參校正，2-ΔΔCt法計(jì)算血清中miR-137、Notch1 相對(duì)表達(dá)量。miR-137 引物：正向5’-UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG-3’，反向5’-CUACGCGUAUUCUUAAGCAAUAA-3’；Notch1 引物：正向5’-GTTGCATAGGTCCCTCGGTT-3’，反向5’-CGTAGCCAAAGACGAACATGC-3’；U6 引物：正向5’-AGCGCCTTGACCTGGACA-3’，反向5’-TCGGCGTGCTCTGGAAAA-3’；GAPDH 引物：正向5’-GAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC-3’，反向5’-GGAGTTGCTGTTGAAGTCAC-3’。

1.2.2 資料收集 收集T2DM 患者性別、年齡、體重指數(shù)、病程、吸煙、飲酒、血壓、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、空腹血糖、糖化血紅白蛋白（glycosylated hemoglobin albumin，HbA1c）。

1.3 分組方法

參考2019 年美國眼科學(xué)會(huì)《糖尿病視網(wǎng)膜病變國際臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》[9]。輕度DR：散瞳眼底檢查見微動(dòng)脈瘤；中度DR：微動(dòng)脈瘤并伴有輕于重度DR 表現(xiàn)；重度DR：符合以下任意一項(xiàng)。①≥1 個(gè)象限有中度的視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常；②≥2 個(gè)象限有靜脈串珠樣改變；③4 個(gè)象限都有嚴(yán)重視網(wǎng)膜內(nèi)出血和微血管瘤。T2DM 患者入院后根據(jù)是否并發(fā)DR 分為DR 組45例和非DR 組102 例。DR 分級(jí)：參考《糖尿病視網(wǎng)膜病變防治專家共識(shí)》[2]將DR 患者分為非增生期組（30例）和增生期組（存在新生血管形成、玻璃體積血、視網(wǎng)膜前出血三項(xiàng)的任一項(xiàng)，15 例）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 28.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較采用U 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析。T2DM 患者并發(fā)DR的影響因素采用多因素logistic 回歸分析。預(yù)測(cè)價(jià)值采用ROC 曲線分析，曲線下面積（area under curve，AUC）比較采用Delong 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T2DM 組與對(duì)照組血清miR-137、Notch1 mRNA表達(dá)比較

T2DM 組血清miR-137 表達(dá)高于對(duì)照組，Notch1 mRNA 表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 T2DM 組與對(duì)照組血清miR-137、Notch1 mRNA 表達(dá)比較（）

表1 T2DM 組與對(duì)照組血清miR-137、Notch1 mRNA 表達(dá)比較（）

注T2DM：2 型糖尿病；miR-137：微RNA-137；Notch1：缺口受體1

2.2 T2DM 患者并發(fā)DR 的單因素分析

DR 組年齡＞非DR 組，T2DM 病程長(zhǎng)于非DR組，F(xiàn)BG、HbA1c、miR-137 高于非DR 組，Notch1 mRNA低于非DR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 T2DM 患者并發(fā)DR 的單因素分析

2.3 DR 患者血清miR-137 與Notch1 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)系數(shù)分析顯示，DR 患者血清miR-137與Notch1 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.780，P＜0.001）。

2.4 增生期組與非增生期組一般資料和血清miR-137、Notch1 mRNA 表達(dá)比較

兩組性別、年齡、體重指數(shù)和T2DM 病程比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。增生期組血清miR-137表達(dá)高于非增生期組，Notch1 mRNA 表達(dá)低于非增生期組（P＜0.05）。見表3。

表3 增生期組與非增生期組一般資料和血清miR-137、Notch1 mRNA 表達(dá)比較

2.5 T2DM 患者并發(fā)DR 的多因素logistic 回歸分析

以年齡、T2DM 病程、FBG、HbA1c、miR-137（≥1.47=1；＜1.47=0）、Notch1 mRNA（≥0.98=1；＜0.98=0）為自變量，是否并發(fā)DR（是=1；否=0）為因變量，建立logistic回歸模型。結(jié)果顯示，T2DM 病程延長(zhǎng)和HbA1c、miR-137≥1.47 為T2DM 患者并發(fā)DR 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Notch1 mRNA≥0.98 升高為獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。見表4。

表4 T2DM 患者并發(fā)DR 的多因素logistic 回歸分析

2.6 血清miR-137、Notch1 mRNA 表達(dá)對(duì)T2DM 患者并發(fā)DR 的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC 曲線分析顯示，血清miR-137、Notch1 mRNA表達(dá)聯(lián)合預(yù)測(cè)T2DM 患者并發(fā)DR 的AUC 大于miR-137、Notch1 mRNA 單獨(dú)預(yù)測(cè)（Z=2.265、2.319，P=0.024、0.020）。見表5、圖1。

圖1 血清miR-137、Notch1 mRNA 表達(dá)預(yù)測(cè)T2DM 患者并發(fā)DR 的ROC 曲線

表5 血清miR-137、Notch1 mRNA 表達(dá)對(duì)T2DM 患者并發(fā)DR 的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

T2DM 是胰島素抵抗或分泌不足所致的代謝性疾病，持續(xù)高血糖滲入眼部會(huì)阻塞毛細(xì)血管和引發(fā)局部炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及缺血缺氧，增加血-視網(wǎng)膜屏障通透性和促進(jìn)新生血管形成，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變甚至完全喪失功能[10-11]。DR 不僅會(huì)嚴(yán)重?fù)p害糖尿病患者視力，還會(huì)增加心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病和全因死亡風(fēng)險(xiǎn)[12-13]，同時(shí)視力受損和喪失也會(huì)嚴(yán)重影響患者心理健康[14]。DR 患者每年進(jìn)展為威脅視力的增生期DR 發(fā)生率為3.4%～12.3%，盡管手術(shù)、激光、玻璃體腔注射藥物治療能改善視力，但視力恢復(fù)并不如意且復(fù)發(fā)率較高[15]。

研究顯示，miRNA 能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、新生血管形成等多種機(jī)制參與DR 的發(fā)生發(fā)展[4，16]。miR-137 定位于人染色體1p21.3，馬歡臨等[17]報(bào)道，miR-137 能靶向白細(xì)胞介素-6 增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Shu 等[18]報(bào)道，miR-137 能靶向Y染色體性別決定區(qū)-盒轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥。Peng 等[19]報(bào)道，上調(diào)miR-137 可導(dǎo)致高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，促進(jìn)新生血管形成和增加血管通透性。本研究結(jié)果顯示，T2DM 患者血清miR-137 表達(dá)上調(diào)，miR-137≥1.47 是DR 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與近期Dos 等[6]報(bào)道m(xù)iR-137 在DR 患者中升高結(jié)果相符。提示，miR-137 表達(dá)上調(diào)會(huì)增加DR 風(fēng)險(xiǎn)，分析原因可能是miR-137 表達(dá)上調(diào)能導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，并刺激新生血管形成，進(jìn)而導(dǎo)致DR 發(fā)生[17-19]。

T2DM 患者視網(wǎng)膜組織因炎癥、氧化應(yīng)激、缺血缺氧等引起的血管病變會(huì)促使新生血管形成，其較薄的管壁極易破裂出血（即眼底出血），模糊視力的同時(shí)血管破壞后形成的瘢痕組織會(huì)牽拉視網(wǎng)膜，導(dǎo)致視網(wǎng)膜破壞甚至脫落，最終引起失明[4]。Notch 信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，能通過與鋸齒狀典型Notch 配體、Delta 樣配體（Delta like ligand，DLL）1、DLL4的相互作用，直接或間接參與血管新生調(diào)控，該信號(hào)通路缺失將導(dǎo)致嚴(yán)重的血管缺陷[20]。Notch1 是Notch信號(hào)通路中主要表達(dá)受體蛋白，DLL4 是其公認(rèn)的受體，DLL4/Notch1 信號(hào)通路激活可抑制VEGF 介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和新生血管形成等過程[21]。Notch1蛋白在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)低表達(dá)，并隨著葡萄糖濃度增高而降低。本研究結(jié)果顯示，T2DM 患者血清Notch1 mRNA 表達(dá)下調(diào)，Notch1 mRNA≥0.98 是DR發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素，這與以下研究報(bào)道結(jié)果相符[22-23]，分析其機(jī)制可能是Notch1 mRNA 上調(diào)能激活DLL4/Notch1 信號(hào)通路，抑制新生血管形成[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)miR-137 與Notch1 mRNA 表達(dá)在DR 患者血清中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能共同參與DR 發(fā)生發(fā)展。近期研究[25-27]亦證實(shí)，下調(diào)miR-137 能靶向上調(diào)Notch1，能阻止DR 發(fā)生。本研究結(jié)果還顯示，增生期組血清miR-137 表達(dá)進(jìn)一步升高，Notch1 mRNA 表達(dá)進(jìn)一步降低，提示，miR-137 表達(dá)高表達(dá)和Notch1 mRNA 低表達(dá)還可能促進(jìn)DR 進(jìn)一步發(fā)展，分析原因可能是miR-137 表達(dá)上調(diào)和Notch1 mRNA 表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)新生血管形成，破裂后形成瘢痕組織牽拉視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致視網(wǎng)膜前出血、玻璃體積血等增生型DR改變。

此外，本研究結(jié)果還顯示，T2DM 病程延長(zhǎng)和HbA1c升高會(huì)增加T2DM 患者并發(fā)DR 風(fēng)險(xiǎn)，分析原因是T2DM 隨著病程延長(zhǎng)，血糖控制不佳率升高，因此DR 風(fēng)險(xiǎn)增加；HbA1c是評(píng)估血糖控制情況的重要指標(biāo)，HbA1c升高反映血糖控制不佳，因此DR 風(fēng)險(xiǎn)增加[28]。最后本研究通過繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，miR-137 聯(lián)合Notch1 mRNA 預(yù)測(cè)T2DM 患者并發(fā)DR 的AUC 較miR-137、Notch1 mRNA 單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC 顯著增加。提示，血清miR-137、Notch1 mRNA 表達(dá)可能成為DR輔助預(yù)測(cè)指標(biāo)，且二者聯(lián)合能提升DR 預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，T2DM 患者血清miR-137 表達(dá)升高，Notch1 mRNA 表達(dá)降低，二者可能共同參與DR 發(fā)生，可能成為DR 輔助預(yù)測(cè)指標(biāo)，且二者聯(lián)合能提升DR預(yù)測(cè)價(jià)值。但本研究還需前瞻性多中心研究驗(yàn)證。