高通量測序技術應用于稽留流產遺傳因素的分析

張 康 李向利 蔣國慶

1.清華大學第一附屬醫院婦科，北京 100016；2.清華大學第一附屬醫院病理科，北京 100016

稽留流產指胚胎或胎兒死亡后滯留在宮腔未能及時排除，是自然流產的一種特殊狀態，其病因復雜多樣，包括染色體、內分泌、免疫、感染、解剖、血栓前狀態等，并且仍有50%病因不明[1-3]。其中，胚胎的遺傳缺陷是導致稽留流產的重要因素[4]。近年來，隨著高通量基因測序技術的發展，絨毛染色體檢測開始廣泛應用于稽留流產原因分析及產前診斷等多個領域。本研究應用高通量測序技術檢測稽留流產患者絨毛組織基因拷貝數變異情況，評估該技術應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年6 月至2020 年6 月清華大學第一附屬醫院門診確診為稽留流產并且行清宮手術的91例患者為研究對象，對流產絨毛組織進行高通量測序分析。孕婦年齡22～42 歲，平均（31.26±4.10）歲；孕齡6～13周，平均（9.15±1.65）周。納入標準：①尿或血絨毛膜促性腺激素陽性；②超聲符合稽留流產指標。排除標準：①孕婦自身內分泌系統異常、支原體及衣原體感染、生殖系統解剖結構異常；②孕期有毒、有害物質接觸史等。患者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準[（2022）倫審研第（57）號]。

1.2 檢測方法

清宮術后，流產組織經無菌生理鹽水洗滌3 次，漂凈后置冰盒保存，送至北京科諾安生物技術有限公司進行高通量測序。采用拷貝數變異檢測試劑盒（貨號：KR2000，杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司），依托基因測序儀（型號NextSeq CN500，杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司），進行全基因組范圍掃描，包括DNA 提取、純化、建庫、測序、信息分析、報告出具等步驟。同時取孕婦外周血2 ml 送檢做參考，以排除絨毛染色體是否受到母源性污染。

2 結果

2.1 絨毛組織高通量測序結果

91 例稽留流產絨毛組織均成功進行高通量測序，成功率為100.00%。21 例（23.92%）染色體正常，70 例（76.08%）染色體異常；有明確致病性50 例（54.94%）；染色體異常樣本中，以染色體數目異常最為常見，三體最多。見表1。

表1 絨毛染色體拷貝數變異結果

2.2 染色體拷貝數變異樣本分析結果

26 例染色體拷貝數變異中，微缺失型6 例、微重復型14 例、混合型6 例。其中6 例具有明確致病性、2例良性、18 例為臨床意義未明的基因組拷貝數變異。相關結果見表2。

表2 染色體拷貝數變異樣本分析結果

2.3 已知致病性拷貝數變異樣本分析結果

6 例具有明確致病性樣本的具體檢測結果見表3。

表3 已知致病性拷貝數變異樣本分析結果

3 討論

近年來，稽留流產發病率逐漸升高，給孕婦及其家庭帶來身體和心理的雙重傷害。稽留流產病因復雜多樣，包括遺傳、免疫、感染、解剖、環境、精神等[4-5]。染色體異常是最常見原因[6]。

傳統的G 顯帶核型分析法被作為檢測染色體數目異常和結構異常的金標準，但其對標本要求高，實驗周期長，且分辨率低，對于＜5 Mb 的微小染色體畸變難以檢出[7]。研究顯示，染色體核型分析正常的細胞中可能存在亞顯微水平的缺失、重復等拷貝數變異[8]。如果拷貝數變異涉及與生長發育相關的重要基因片段的缺失、插入或重復，最終可能會導致胎兒死亡或流產[9]。熒光原位雜交法雖然檢測時間短，但只能對13、16、18、21、22、X 和Y 染色體進行檢測，不能分析全部染色體和全基因組結構，且有20%漏診的概率[10-11]。本研究應用高通量基因測序技術拷貝數異常，不僅能檢測46 條染色體非整倍體異常，還能檢測出＞100 kb 片段的微缺失、微重復，發現新的染色體變異。該項技術對絨毛組織要求低，分辨率高，檢測速度快，最大的優勢在于可以發現不同區域染色體拷貝數變異，具有極高的靈敏度和特異度[12]，彌補染色體核型分析和熒光原位雜交法的不足，使得流產的病因學診斷更全面[13-14]。

本研究采用高通量測序檢測絨毛組織的同時，抽取母親外周血進行結果驗證，排除母體細胞污染的影響，使結果更加準確。全部標本均成功進行染色體檢測，說明該技術比以往檢測技術更加可靠。本研究結果顯示，91 例樣本中，檢測出拷貝數異常的樣本共70例，異常率為76.08%，有明確致病性50 例（54.94%），與既往文獻[13,15-16]報道的染色體異常率一致。本研究結果顯示，以染色體數目異常最為常見，三體最多；非整倍體中，21-三體所占比例最高，有5 例，其次是15-三體、16-三體。與既往研究[17-18]（常染色體三體是染色體異常的主要核型）相符。由此可見，染色體數目異常是胚胎停育的主要原因[19]。

染色體拷貝數變異共26 例，其中重復有14 例、缺失有6 例、混合型6 例；重復率高于缺失率，與張攀等[20]研究結果一致，提示染色體的重復比起缺失可能更容易影響胚胎的發育。本研究中明確有致病性拷貝數變異6 例、良性2 例、臨床意義未知18 例。由于目前技術有限，這些缺失或重復片段的致病性還沒有完全明確，由于其結構異常片段相對較小，容易得到基因補償而無特殊臨床癥狀表現。染色體微缺失或微重復是患兒多發畸形的主要原因[21-22]，但與稽留流產是否相關還需要進一步研究來證實。

目前，人類基因數據庫無法對全部的結果進行臨床性質判斷，所以對于臨床意義未明的拷貝數變異無法明確是否會導致不良妊娠，還需要更多的研究來明確。如果檢測結果為染色體數目異常，考慮遺傳之外的因素所致概率較高，如環境、感染、高齡等因素，導致生殖細胞或受精卵在早期有絲分裂過程中出現染色體不分離或者丟失，可基本排除來自夫妻雙方的遺傳畸變，需要告知夫妻盡可能避免接觸導致染色體異常的不良因素。如果絨毛組織存在拷貝數變異，則需要進一步分析拷貝數變異是否來自親代，抑或是新發突變，建議夫妻雙方均檢測染色體拷貝數變異，并輔以家系綜合評估，確定該缺失或重復的來源，分析拷貝數變異的多態性影響。無論為新發突變還是來自雙親遺傳，再次妊娠時都需要進行遺傳咨詢和產前診斷。任何一項技術都具有局限性，拷貝數變異目前無法檢測出染色體平衡性結構異常（包括染色體平衡易位及倒位）、多倍體等[23]，還需要結合染色體核型分析進行診斷[24-27]。

綜上所述，染色體異常是早孕期稽留流產的主要原因，其中又以染色體數目異常為主。在染色體亞顯微水平上，高通量測序技術具有明顯優勢，可以更高效、靈敏、準確地檢測絨毛染色體數目異常和拷貝數變異，是對傳統絨毛核型分析的有效補充，有助于全面明確稽留流產的病因，為夫妻雙方再次生育提供更有意義的優生遺傳咨詢和指導。