生物素導致電化學發光法檢測高敏肌鈣蛋白T 假陰性1 例

王曉燕 李玉杰 武雙全 李佩佩

患者，男，44 歲，因“反復胸悶痛2h”于2023 年1 月23 日就診于我院。患者無明顯誘因反復出現心前區悶痛，持續不緩解。無咳嗽，無呼吸困難，無雙下肢水腫，無端坐呼吸，無心悸，無視物旋轉，無頭痛，無乏力，無反酸、噯氣，無惡心嘔吐，伴頭暈，無雙眼黑矇、暈厥等。為明確病因就診于急診，考慮急性心肌梗死，開通綠色通道行急診造影。造影示：左主干無狹窄；前降支彌漫性斑塊浸潤，近段約50%狹窄，D1 中段約80%狹窄，血流TIMI3 級；回旋支彌漫性斑塊浸潤，中段約95%狹窄，血流TIMI3 級；右冠狀動脈細小，中段約80%狹窄，血流TIMI3 級。既往有“高血壓3 級、痛風、腎結石”病史，自服藥物治療，具體不詳；否認肝炎、結核等傳染病史，否認外傷史，否認輸血史，否認食物、藥物過敏史，否認家族傳染病、代謝性、遺傳性疾病及類似病史。體格檢查：T 36.3℃，P 80次/min，R 18 次/min，BP 110/80mmHg。心律齊，心音有力，P2＜a2。各瓣膜聽診區未聞及病理性雜音，未聞及心包摩擦音。實驗室檢查：高敏肌鈣蛋白T（High-sensitivity troponin T，hs-cTnT）為0.008ng/mL（0～0.014 ng/mL），肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）為80.79ng/mL（28～72ng/mL），肌酸激酶MB 同工酶（Creatine kinase-MB，CKMB）為2.11ng/mL（0～5ng/mL），N 端腦鈉肽前體（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide，NTproBNP）為48.50pg/mL（0～450pg/mL）。心電圖示：竇性心動過緩，異常Q 波（Ⅱ、Ⅲ、aVF），ST 段抬高（Ⅱ、Ⅲ、AVF、V5、V6），下壁心肌梗死。初步診斷：①冠心病，急性ST 段抬高型心肌梗死，心功能Ⅱ級（Killip）；②高血壓3 級（很高危）；③痛風；④4 腎結石。患者于LCX 植入冠狀動脈支架1 枚后安返病房。

次日，患者再次監測心肌損傷指標及NTproBNP：hs-cTnT 為0.011ng/mL，Mb 為152.26ng/mL，CK-MB 為293ng/mL，NT-proBNP 為776.11pg/mL。結果提示，除hs-cTnT 外，其余心肌損傷指標均大幅升高。其他異常指標包括：游離三碘甲狀腺原氨酸（Free triiodothyronine，FT3）6.35pg/mL，游離甲狀腺素（Free thyroxine，FT4）3.85ng/dL、三碘甲狀腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）2.36μg/mL、甲狀腺素（Thyroxine，T4）19.86μg/dL，促甲狀腺激素促甲狀腺素（Hyroid stimulating hormone，TSH）0.21uIU/mL，白細胞計數（WBC）27.62×109/L，中性粒細胞百分率82.8%，單核細胞百分率5.2%，中性粒細胞絕對數22.87×109/L，尿酸541.0μmol/L，天門冬氨基酸轉移酶274.7U/L，α 羥基丁酸脫氫酶576.0U/L，小而密低密度脂蛋白膽固醇1.39mmol/L，載脂蛋白B1.35g/L，丙肝抗體陽性為20.600COI，尿隱血4+，而血紅蛋白、血小板、紅細胞沉降率、谷丙轉氨酶、總膽紅素、肌酐、尿素、空腹血糖、糖化血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、電解質、D-二聚體、腫瘤標志物、凝血8 項、丙肝RNA 確診實驗，梅毒螺旋體抗體、人免疫缺陷病毒抗體、乙肝表面抗體、乙肝e 抗原、乙肝e抗體、乙肝核心抗體、乙肝表面抗原、抗鏈球菌溶血素O、類風濕因子、抗核抗體、巨細胞病毒核酸、EB病毒核酸、血尿免疫固定電泳等均無明顯異常。患者有明確的急性心肌梗死癥狀和體征，冠脈造影、心電圖及心肌酶譜監測均提示心臟損傷，但hscTnT 濃度正常未升高。另外，患者的甲狀腺功能檢測提示Graves 病，但患者無相應臨床表現。甲狀腺彩超示：甲狀腺大小形態可，實質回聲均勻，彩色多普勒血流顯像正常。

我院hs-cTnT 檢測平臺為Cobas e601 原裝系統，配套試劑。檢驗方法學為電化學發光法，該方法是基于生物素-親和素系統（Biotin-avidin system，BAS）免疫捕獲放大標記技術。在確認標本無溶血、脂血、高膽紅素、高血紅蛋白，hs-cTnT 質控正常的基礎上，進行標本復測和連續稀釋測定（見表1），排除了隨機誤差和高濃度Hook 效應。最終我們考慮藥物或患者體內存在未知干擾因素，導致hs-cTnT 濃度的假性降低。通過與患者及家屬的溝通，我們獲知患者為改善發量稀疏和發際線后移的狀態，10 天前在某平臺購買“防脫發黑科技”產品并持續服用，通過鏈接詳情查閱其有效成分為生物素，每粒含量高達1 000mcg（1mcg=1μg）。我們使用hs-cTnT 試劑盒中試劑-工作溶液M（包被鏈霉親和素的磁珠微粒，1 瓶12.4mL；包被鏈霉親和素的磁珠微粒0.72mg/mL；防腐劑）進行同批標本的中和處理后再測（見表1），檢測結果大幅升高，確定了生物素造成了hs-cTnT 的假性降低。另外，甲狀腺相關激素的檢測系統，也是基于BAS 化學發光反應原理的羅氏平臺（Cobas，Elecsys，Modular），因TSH用夾心法模式而結果假性減低，T3、T4、FT3、FT4采用競爭法模式而結果假性升高，同樣使用中和處理后再測（見表2），檢測結果基本恢復正常。

表1 hs-cTnT 標本復測、連續稀釋測定和中和處理后再測結果

表2 甲狀腺相關激素中和處理后再測結果

討論肌鈣蛋白T（Troponin T，cTnT）是參與橫紋肌收縮的一種調節蛋白，是心肌損傷特異性和高敏感性的標志物。研究顯示[1]，hs-cTnT 有助于將急性冠脈綜合征（ACS）的觀察時間從6h 縮短到3h，也從根本上改變了ACS 診斷、預后判斷、治療和危險分層的格局。近年歐洲心臟病協會（ESC）、美國心臟病協會（AHA）、國家臨床檢驗師協會（NICE）陸續發布了hs-cTnT 的臨床應用指南，并持續細化更新。然而在臨床檢驗中，hs-cTnT 的檢測受到測試平臺、方法學、標本中內源性干擾物質的因素限制，出現檢測結果假陽性的案例不斷被報道[2]。目前，國外基于BAS 電化學發光技術檢測hs-cTnT 的假陰性案例鮮見[3]，國內尚未查閱到相關文獻。

BAS 電化學發光技術檢測hs-cTnT 受到多種因素干擾（見表3），本例患者標本血清膽紅素、血紅蛋白、血脂、類風濕因子、白蛋白均在正常值范圍，高濃度hook 效應通過稀釋測定予以排除，同時未查閱到痛風和腎結石合并hs-cTnT 假陰性的報道，本中心推測，藥物或內源性生物素干擾BAS 免疫捕獲反應，結合中和實驗結果，驗證了內源性生物素導致hs-cTnT 檢測的假性降低。

表3 BAS 電化學發光技術檢測hs-cTnT 的局限性（Cobas）

生物素（Biotin）為B 族維生素之一，又稱維生素H、維生素B7、輔酶R（Coenzyme R）等，是20 世紀30 年代在研究酵母生長因子和根瘤菌的生長與呼吸促進因子時，從肝中發現的一種可以防治由于喂食生雞蛋蛋白誘導的皮膚損傷和大鼠脫毛的營養因子。目前，相較于美國人群，中國人群的適宜推薦量偏低[4，5]。近年來，生物素被廣泛應用于生物素缺乏癥、代謝性疾病、甲狀腺功能亢進、多發性硬化癥、維生素D 中毒等的臨床治療[6]和美甲、美發、預防少年白發、孕期營養保健等領域[7]。口服生物素迅速從胃和腸道吸收，血液中的生物素80%以游離形式存在。生物素對BAS 免疫捕獲技術（雙抗體夾心法圖1）的干擾機制為內源性生物素和試劑盒中的生物素會競爭性結合鏈霉親和素磁微粒（Streptavidin-coated microparticles，M）[8]，致使反應體系中生物素的總量超出了M 的結合能力，導致捕獲的發光物質減少[9]，光信號減弱，從而引起檢測結果的假性減低[10]；對BAS 免疫捕獲技術（競爭法圖2）的干擾機制是生物素抑制生物素-鏈霉親和素標記抗體固定，從而使得檢測結果假性升高[11]。

圖1 雙抗體夾心法反應原理

圖2 競爭法反應原理

2017 年11 月，美國食品和藥物管理局（FDA）公布一份由于生物素干擾而導致肌鈣蛋白測定不準確引起患者死亡的報告，提醒臨床醫生及實驗室工作者：大劑量補充生物素可能會導致實驗室檢測結果出現誤差，從而引起臨床誤診誤治[12]；Li 等[13]的研究結果顯示，當生物素濃度達到31.3ng/mL 時，肌鈣蛋白水平會顯著降低，降低比例接近20%。自此，生物素對于hs-cTnT 檢測的干擾引起了多位學者的關注，目前已證實與多種因素相關，如檢測平臺[14]、檢測項目[15]、反應模式[16]、反應體系中各組分占比[9]等，與待測物水平無關[8]。FDA 建議[12]：如果實驗室檢測結果與患者的臨床表現不符，應考慮將生物素干擾作為可能的原因。Piketty 等[15]研究發現，Cobas 平臺的所有項目均易受到樣本來源的生物素干擾，而Centaur 平臺中已經通過生物素試劑-鏈霉親和素磁微粒的預制，所以抗生物素干擾能力最強。這提示我們，標本的M 中和處理，可有效減低生物素干擾作用，這與Piketty 等[16]和Yang等[17]研究相符。

本例患者有典型的急性冠脈綜合征體征，冠脈造影和心電圖檢查均提示心肌受損，但hs-cTnT 的連續監測結果并未出現劑量-釋放曲線的一般特征，在排除標本因素和其他實驗因素外，應及早考慮生物素導致hs-cTnT 假性降低的可能，并通過M中和處理進行驗證。在本研究中，患者合并痛風和腎結石，或者患者體內是否存在其他導致hs-cTnT假性降低的干擾因素，我們尚未可知。另外，臨床對生物素如何干擾檢測項目的了解仍然太少。生物素的服用劑量、服用時間及受影響的項目類型等，仍需要進一步系統的研究評估。

目前hs-cTnT 的檢測技術，國際上以Cobas 平臺為代表已經實現了檢測的國際標準化，國內重慶中元匯吉等民族企業也在迅速崛起。Cobas 公司于2019 年開發出了生物素特異性磁性納米載體，作為抗生物素干擾組分添加至反應體系中，通過特異性結合游離生物素，從而減少生物素干擾，但目前尚未進入市場。所以從檢驗的局限性入手，當hscTnT 檢測結果與臨床綜合表現不相符時，要及時與臨床溝通，警惕隨機誤差的可能，更要對造成檢測項目假性升高或減低的干擾因素進行驗證和探討，如更換檢測平臺，更換方法學，進行標本的中和處理等，以保證檢測結果的準確可靠。