乳腺癌類器官疾病模型的構建及其對化療藥物的敏感性試驗

吳銘 初新宇 付陽 王雪薇 王歡 肖洋 陳棟 何勁松

1安徽醫科大學北京大學深圳醫院臨床學院（廣東深圳 518036）；2安徽醫科大學第五臨床醫學院（合肥 230000）；3北京大學深圳醫院乳腺甲狀腺外科（廣東深圳 518036）

乳腺癌（breast cancer，BC）是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一。根據2019 年發布的數據，乳腺癌占女性新診斷惡性腫瘤的30%，并導致15%的女性死于乳腺癌［1］。目前乳腺癌的治療方法主要包括手術治療，常規放化療，內分泌治療，以及人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達時使用的靶向治療。近年來，乳腺癌靶向治療取得了較大進步，但大部分乳腺癌仍缺乏針對性治療靶點，影響臨床療效［2］。雖然乳腺癌已經被廣泛研究，但我們仍然迫切需要一種新的臨床前疾病研究模型來指導患者的個性化治療。

傳統二維（two-dimensional，2D）培養的腫瘤細胞系和腫瘤異種移植動物模型（patient-derived xenografts，PDX）作為臨床前研究模型被廣泛使用。然而2D 培養的腫瘤細胞無法還原患者體內腫瘤的復雜結構和病理特征，PDX 模型構建效率低、耗時長、費用昂貴、存在種屬差異，不適合高通量藥物篩選［3］。近年來，腫瘤類器官技術的出現與發展，為我們提供了新型的臨床前研究模型。類器官是在體外對干細胞或器官祖細胞進行誘導分化形成的在結構和功能上類似目標器官或組織的三維細胞復合體，其具有穩定的表型和遺傳學特征，能夠在體外長期傳代培養。患者衍生的癌癥類有機物允許癌細胞在三維基質中生長，并以及時且具有成本效益的方式從患者體內培養癌癥細胞的能力取得了重大進展［4-7］，不僅概括了原始腫瘤的組織學和遺傳特征，還允許高通量藥物篩選，并可能促進個性化治療［8］。目前，肺癌［9］、肝癌［10］、胰腺癌［11］、膀胱癌［12］、胃癌［13］、子宮內膜癌［14］及鼻咽癌［15］等多種腫瘤類器官模型已成功建立，乳腺癌類器官也已成為一種有用的臨床前模型，本研究擬建立不同分子分型的乳腺癌類器官模型，并進行化療藥物篩選，為乳腺癌基礎研究與臨床個性化治療提供新型的實驗模型。

1 材料與方法

1.1 乳腺癌組織本研究于2021 年7-12 月采集北京大學深圳醫院收治的4 例乳腺癌患者新鮮腫瘤組織標本，其中2 例組織學分型為HER2（+）型乳腺癌，1 例為三陰性乳腺癌（TNBC），1 例為激素受體陽性型（LuminalB）乳腺癌。獲取的新鮮腫瘤組織將分成幾部分，分別進行類器官培養與病理石蠟切片形態學染色。本研究已獲得北京大學深圳醫院倫理委員會的批準［北大深醫倫審（研）［2019］第（062）號］。

1.2 實驗試劑主要包括：AdvancedDMEM/F12 培養基（Gibco，美國），Ⅱ型膠原酶（Gibco，美國），Matrigel（Corning，美國），Ki67、ER、PR、HER2 免疫組化抗體（Abcam，英國），濃縮型DAB 試劑盒（MXB，中國），抗菌劑（Gibco，美國），HEPES（Gibco，美國），GlutaMAX（Gibco，美國），TrypLEExpress（Gibco，美國），Y-27632 二鹽酸鹽（AbmoleBioscience，美國），CellTiter-Glo?3DReagent（Promega，美國），細胞回收液（康寧，美國），維生素煙酰胺（SigmaAldrich，美國），抑制劑Noggin（Peprotech，美國），表皮生長因子（EGF），成纖維細胞增長因子10（FGF-10，Peprotech，美國），激活素受體樣激酶（ALK）抑制劑A83-01（SigmaAldrich，美國），p38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑SB202190（SigmaAldrich，美國）。

1.3 設備主要包括：二氧化碳培養箱（賽默飛，美國），生物安全柜（ESCO，美國），水浴鍋，高壓滅菌鍋，石蠟切片機（Leica，德國），全自動脫水機（Epredia，美國），石蠟包埋機（賽默飛，美國），病理組織漂烘儀（郝思琳，中國），正置顯微鏡（ZEISS，德國），低速離心機（Eppendorf，德國），多功能全波長酶標儀（BioTek，美國）。

1.4 方法

1.4.1 乳腺癌類器官培養基的配制AdDMEM/F12+++培養基中加有維生素煙酰胺（10 mmol/L），抑制劑Noggin（100 ng/mL），EGF（50 ng/mL），FGF-10（10 ng/mL），A83-01（500 nmol/L），SB202190（10 μmol/L），Y-27632（10 μmol/L），Wnt-3A 以及Matrigel 膠。

1.4.2 乳腺癌類器官的培養將新鮮標本冰上運送至實驗室立即處理。使用PBS 清洗標本3～5 次，部分組織固定在甲醛中進行后續實驗，剩余組織用來建立類器官模型。在超凈臺內用眼科剪將乳腺癌組織剪碎，使用Ⅱ型膠原酶，在37 ℃水浴鍋中消化40～60 min 后使用含10% FBS 的AdDMEM/F12+++培養基終止，離心棄上清，洗滌一次后使用70 μm 的細胞篩過濾以去除未消化的組織塊，將得到的細胞懸浮液離心后棄上清，再用移液槍吸取預冷的Matrigel 膠混合細胞懸液，以45 μL每個膠滴接種于37 ℃預熱的6 孔板中，每孔6 膠滴，置于培養箱20 min 使基質凝膠聚合后，每孔加入2.5 mL 乳腺癌類器官培養基，放至37 ℃培養箱中培養。光學顯微鏡下觀察類器官的形成和生長狀態。每2～3 天換液，視類器官生長速度每1～3 周以1∶2～1∶4 的稀釋度進行傳代。

1.4.3 乳腺癌組織及類器官石蠟切片的制備新鮮的乳腺癌組織置于10%中性甲醛中固定24 h。收集乳腺癌類器官，棄去培養基，向每孔中加入1 mL 4 ℃預冷的細胞回收液解聚基質凝膠，收集每個孔的類器官離心棄上清，加200 μL 液態的瓊脂糖凝膠，將類器官沉淀從底部吹起，待瓊脂糖凝膠凝固后，置于10%中性甲醛中固定12 h。乳腺癌組織及類器官固定結束后，按照常規程序進行脫水、石蠟包埋、切片（4 μm）。

1.4.4 HE 及免疫組織化學染色HE 染色：石蠟切片脫蠟至水后，蘇木素染細胞核，伊紅溶液染細胞質，脫水透明后中性樹脂封片，干燥后使用正置顯微鏡進行拍攝。

免疫組化染色：石蠟切片經脫蠟復水、過氧化氫酶阻斷、抗原修復及血清封閉，將Ki-67、ER、PR和HER-2 抗體按照1∶300 濃度稀釋后，于4 ℃下孵育切片過夜。次日，用PBS 沖洗3 遍后按照濃縮型DAB 試劑盒說明書操作步驟染色，然后使用蘇木精復染，中性樹脂封片干燥后使用正置顯微鏡進行拍攝。

1.4.5 藥物敏感性實驗實驗前將CellTiter-Glo?3D 檢測置于室溫平衡30 min，輕微翻轉混勻；使用TrypLE Express消化乳腺癌類器官，用含2%Matrigel的類器官培養基重懸類器官，然后均勻分配到透明的低吸附性的96 孔板中，100 μL/孔；預培養2 d后，加入100 μL 按5 倍濃度梯度稀釋的化療藥物，再繼續培養5 d。藥物分別為：紫杉醇、多西他賽、長春瑞濱、卡巴他賽、多柔比星，順鉑和吉西他濱，藥物濃度分別為：10 μm、2 μm、0.4 μm、8 × 10-2μm、1.6 × 10-2μm、3.2 × 10-3μm；設置只加DMSO 的孔作為對照組。藥物孵育結束后，將孔板室溫平衡30 min 后，吸去上層100 μL 培養基，然后加入100 μL CellTiter-Glo?3D 試劑，避光置于搖床上反應30 min。在多功能全波長酶標儀上讀取化學發光值，體外試驗重復3 次。使用GraphPad Prism 9分析數據。

2 結果

2.1 乳腺癌類器官模型的建立本研究從接受外科手術的4 例乳腺癌患者（表1）的手術標本中獲取部分腫瘤組織，經過剪切、消化、過濾后得到乳腺癌細胞（圖1），使用Matrigel 膠懸浮后接種在培養皿中，均成功培養成類器官。在Matrigel 膠作為生長支架和類器官培養基細胞因子的作用下，乳腺癌細胞團能夠持續生長分裂，形成乳腺癌3D 細胞團（圖2）。此乳腺癌類器官可持續生長，并可以持續傳代5 代以上。

圖1 乳腺癌類器官模型的建立Fig.1 Establishment of a breast cancer organoid model

圖2 乳腺癌類器官光鏡圖Fig.2 Photomicrographs of breast cancer organoids

表1 乳腺癌患者臨床信息Tab.1 Clinical information for breast cancer patients

2.2 乳腺癌類器官組織學特征將乳腺癌類器官脫水包埋制成石蠟切片，與類器官來源的親本腫瘤組織的切片同批次進行HE 染色。見圖3，乳腺癌類器官表現出與其來源的原發腫瘤組織相似的組織學特征。來自不同患者的乳腺癌類器官的組織學特征上存在差異。例如，我們觀察到BC-2_O和BC-3_O 表現為由多層細胞組成的致密球體，而BC-1_O 表現出較為分散的細胞狀態。

圖3 乳腺癌組織與對應類器官HE 染色特征對比Fig.3 Comparison of HE staining characteristics of breast cancer tissues with corresponding organoid

2.3 乳腺癌類器官免疫組織化學染色ER、PR、HER2 和Ki67 被認為是乳腺癌臨床診斷和實驗室測試的潛在標志物。我們在免疫組化染色后使用顯微鏡觀察發現HER2（+）模型乳腺癌組織（BC-2_T、BC-3_T）中HER2 呈陽性表達，與之對應的乳腺癌類器官（BC-2_O、BC-3_O）HER-2 免疫組化呈強陽性，提示乳腺癌類器官可能富集了親本腫瘤組織中HER2 的乳腺癌干細胞（圖4）。ER 與Ki67在激素受體陽性乳腺癌組織（BC-4_T）與衍生類器官（BC-4_O）都高度表達，而PR 在腫瘤組織及對應的類器官的表達不完全對稱。BC 組織類器官對中，激素受體和HER2 狀態得以維持。值得注意的是，TNBC 模型乳腺癌組織（BC-1_T）Ki67 熱點區達90%，對應類器官（BC-1_O）有輕微表達。可以認為乳腺癌組織類器官對中，激素受體和HER2 狀態得以維持。但不可否認腫瘤類器官可以概括其原始腫瘤的組織學特征和標記物表達。

圖4 乳腺癌組織及其對應類器官ER、PR、HER-2 和Ki-67 免疫組化染色Fig.4 Immunohistochemical staining of breast cancer tissue and its corresponding organoid for ER，PR，HER-2 and Ki-67

2.4 乳腺癌類器官藥敏檢測圖5 展示了入組的4 例乳腺癌類器官在紫杉醇、多西他賽、長春瑞濱、卡巴他賽、多柔比星、順鉑和吉西他濱作用后隨藥物濃度變化的細胞活力。不同分子亞型的乳腺癌對同一種藥物的敏感性不盡相同，同一患者對不同化療藥物的敏感性也不同。其中，三陰性乳腺癌類器官（BC-1_O）對紫杉醇和多柔比星呈劑量依賴關系，但是敏感度欠佳。激素受體陽性模型乳腺癌類器官（BC-4_O）對多柔比星高度敏感，對其余藥物表現出明顯的抵抗力，尤其是卡巴他賽和順鉑。我們可以發現隨著藥物濃度的增加，細胞活力未見明顯變化，甚至呈增加的趨勢。BC-2_O、BC-3_O 類器官系因為HER2 陽性，目前臨床上主要使用靶向藥物治療。在本研究中，可以發現它們都對多柔比星高度敏感，多柔比星通過抑制腫瘤細胞DNA 的復制從而起抑制腫瘤的作用。隨著藥物濃度的增加，HER2（+）型乳腺癌類器官的細胞活力呈明顯的下降趨勢。

圖5 乳腺癌類器官的藥敏結果Fig.5 Drug sensitivity results of breast cancer organoid

3 討論

腫瘤異質性被認為是癌癥治療失敗的主要原因。乳腺癌患者對化療藥物的耐藥性與其具有的高度異質性有著密不可分的關系。耐藥性的表現與癌癥的變化一樣具有多樣性，不管給藥機制如何（靶向藥物治療、化療或免疫治療），癌癥患者幾乎普遍存在耐藥性且預后較差。因此建立個體化的臨床前模型對于預測乳腺癌的藥物反應和制定有效的治療策略至關重要。

類器官是一種復雜的三維結構，在結構和功能上與體內器官相似，能夠很大程度上還原親本腫瘤的組織學特征。與傳統2D 培養的腫瘤細胞系和PDX 模型相比，患者來源的腫瘤類器官具有個體化、培養周期短、與來源組織差異小的優勢，可以快速進行高通量篩藥得出藥敏結果，還可以預測患者對新的治療方案的反應，包括化療與靶向藥物的組合或是可添加到患者首輪治療中的多種靶向藥物［16］，可以真正實現腫瘤的個體化治療。

研究數據表明，類器官培養是研究乳腺癌風險和藥物開發的寶貴平臺［8，17］。乳腺癌類器官模型可以從接受新輔助化療和多重耐藥的乳腺癌患者的殘余腫瘤，以及同一患者的原發腫瘤和轉移性腋窩淋巴結及遠處器官轉移成功建立［8，18］。然而乳腺癌具有多種分子分型，其治療方法及預后均有顯著差異。本研究選擇不同分子亞型乳腺癌組織，構建乳腺癌類器官模型作為藥物測試平臺。對于三陰性乳腺癌和激素受體陽性乳腺癌，我們可以觀察到腫瘤和衍生類器官之間的對應性并不十分強烈，這可能跟腫瘤組織取樣和類器官的培養過程有關。除此之外，腫瘤的內在特征可能會影響類器官的生長效率［19］，導致某些腫瘤亞克隆的丟失，從而導致腫瘤-衍生類器官匹配不良。盡管類器官能夠還原體內腫瘤發展過程中的關鍵特征，但類器官本質是體外模型，缺乏與腫瘤微環境成分（如基質、血管、免疫細胞、微生物群等）的相互作用，取得的結果可能并不盡如人意。如果從乳腺癌針刺活檢中產生類器官，藥物試驗與相應患者臨床治療并行，可以作為乳腺癌患者有效的篩藥平臺，有望為實現乳腺癌患者的個性化精準治療提供試驗數據。

我們篩選了7 種藥物，發現類器官對多柔比星（一種蒽環類化療藥物）和吉西他濱這兩種藥物的敏感性顯著。研究證實使用含帕妥珠單抗方案對HER2 陽性乳腺癌患者進行新輔助治療有明顯療效，聯合含蒽環類藥物有更好獲益可能，且安全性良好［20］。

本研究中入組患者按照指南和病情制定合適臨床化療方案，對應類器官使用同樣的藥物進行篩藥，篩藥結果與患者治療情況基本一致。我們的結果表明這些藥物在治療乳腺癌方面具有潛在的應用價值。

綜上所述，本研究開發了類器官模型作為實時平臺，以指導不同分子亞型乳腺癌的臨床藥物治療，表明使用類器官作為藥物測試平臺指導癌癥患者的個性化治療具有潛在的可行性。下一步需要招募更多的患者進行前瞻性臨床研究這對于乳腺癌的早期篩查及早期治療具有重大意義。