85525例無創產前檢測發現罕見常染色體三體結果分析

張苗苗 方玉琴 李景然 王朝紅 孫玉秀 朱健生

安徽醫科大學附屬婦幼保健院（合肥 230000）

無創產前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）自問世以來，以分析孕婦外周血中的胎兒游離DNA（cell-free foetal DNA，cffDNA）為基礎，在產前診斷領域迅速推廣［1］。由于NIPT 方法的全基因組性質，已經擴大了篩查范圍，不可避免地會發現罕見常染色體三體（rare autosomal trisomies，RATs），定義為21、18 或13 號染色體以外的常染色體三體，但是對于RATs 的研究較少，其應用價值尚存爭議，還需要更多的驗證證據［2-3］。其次，RATs 并不罕見，在產科人群中檢測到RATs 的頻率為0.18%左右，NIPT 對RATs 的陽性預測值（positive predictive value，PPV）較低（4%～6%）［4］，假陽性高的主要原因為限制性胎盤嵌合（confined placental mosaicism，CPM）的存在，導致RATs 高風險通常與胎兒-胎盤疾病風險增加相關［5］，但是，關于RATs 的發病率和妊娠結局的報道仍然有限，出于這個原因，這種意外的發現通常會使遺傳咨詢變得困難，了解RATs 臨床意義的必要性已經變得迫切。因此，本研究納入了目前國內最大的樣本量，旨在探討NIPT 在篩查RATs 的準確性以及RATs 高風險的孕婦是否會發生不良妊娠結局，首次對RATs 進行各條染色體的詳細分析，評估不同染色體之間存在的差異，以期幫助改善妊娠管理。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2018年1月1日至2022年6月1 日在安徽省婦幼保健院接受NIPT 的85 525 例孕婦（年齡：18～35 歲），納入標準如下：（1）孕周12+0～26+5；（2）單胎妊娠；（3）孕婦血清學篩查臨界風險值（1/1 000 ≤T21＜1/270，1/1 000 ≤T18＜1/350），孕婦血清學篩查高危值（T21 ≥1/270，T18 ≥1/350）；（4）B 超提示胎兒單項軟指標異常。排除標準如下：（1）胎齡＜12 周；（2）雙胎或者多胎妊娠；（3）B 超顯示胎兒結構畸形；（4）配偶其中一方明確染色體異常；（5）1年以內接受過異體輸血、干細胞治療、移植手術或免疫治療的孕婦；（6）患有惡性腫瘤的孕婦；（7）因嚴重溶血、凝血、游離DNA 含量低等原因復檢不合格的樣本。本研究得到了安徽醫科大學倫理委員會的批準。所有患者在檢測前進行臨床遺傳學家的咨詢，并在采血前簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 NIPT 檢測NIPT 使用無菌EDTA 抗凝管采集每位孕婦外周血5 mL，在安徽省婦幼保健院遺傳實驗室進行兩步離心法，分離血漿，使用QIAAMP 循環核酸試劑盒（QIAGEN）磁珠吸附提取法提取DNA，隨后用末端修復酶進行末端修復，標記接頭并用連接酶連接接頭，最后通過聚合酶鏈式反應將DNA 擴增到所需的濃度完成文庫構建；利用NextSeqCN500 測序儀進行高通量測序和生物信息學分析，并與人類基因組參考序列圖進行比較，NIPT 結果以Z 值風險評分表示：評分≥3或≤-3 被認為是高風險，評分-3～3 被認為是低風險。

1.2.2 侵入性產前診斷

1.2.2.1 染色體核型分析在超聲引導下進行羊水穿刺術，抽取20～30 mL 羊水，進行接種、培養、G 顯帶，使用GSL-120 型自動核型掃描儀進行核型掃描。根據《國際人類細胞遺傳學命名系統，ISCN2020》指南進行核型描述。

1.2.2.2 染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）同上采集羊水細胞后，進行離心沉淀，提取DNA，根據AffymetrixCytoScan 750K 芯片操作規程，進行SNP 芯片檢測，收集數據，參考公共數據庫（Clingen、Decpher、ClinVar、OMIM、DGV、ISCA、NCBI、UCSC）中的文獻進行綜合分析。

1.2.3 隨訪所有孕婦均通過電話或電子病歷系統進行隨訪，隨訪內容包括分娩記錄、實驗室篩查、胎兒超聲檢查、細胞遺傳學測試和新生兒體檢報告。結果衡量標準：根據出生孕周，新生兒分為足月兒（≥37 周）、早產兒（preterm birth，PTB）（32～37 周）和極早產兒（＜32 周）；胎兒生長受限（fetal growth restriction，FGR）的標準依據新生兒出生體重低于同孕齡正常體重的第10 百分位數［5-6］。

2 結果

2.1 RATs 高風險的NIPT 結果85 525 例孕婦中篩查出182 例RATs 高風險，頻率為0.21%（182/85 525），按降序排列，T7（7 號染色體三體）、T8、T16和T20 較常見（≥15 例）；T10、T9、T3、T2、T11、T15、和T22 中等頻率（5～15 例）；T14、T17、T1、T5、T6和T12 相對少見（＜5 例）；未檢測出T4 和T19。見圖1。

圖1 NIPT 檢出RATs 在不同染色體上的分布Fig.1 The distribution of RATs on different chromosomes by NIPT

2.2 RATs 高風險的產前診斷結果182 例孕婦經過詳細的遺傳咨詢，46 例拒絕侵入性產前診斷，其余136 例進行羊膜腔穿刺術，行羊水核型分析或CMA 檢測，檢測出7 例真陽性（PPV：5.15%），分別為兩例T2、1 例T9、1 例T7、1 例T15 和2 例T16。PPV 分別為50.0%（2/4）、3.13%（1/32）、12.5%（1/8）、33.3%（1/3）和12.5%（2/16），其他染色體的PPV 均為0.00%，總PPV 為5.15%。見表1。

表1 孕婦行NIPT 及侵入性產前診斷的結果Tab.1 Results of NIPT and invasive prenatal diagnosis in pregnant women 例

行CMA 檢測的孕婦中發現了5 例雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH），1 例LOH（6），CMA 結果為6p25.3p22.3 區域15.57 Mb 及6q24.3q27 區域22.15 Mb 雜合性缺失，進一步家系驗證為母源性單親二倍體（uniparentaldisomy，UPD）；1 例LOH（10），CMA 結果為10 號染色體雜合性缺失；2 例LOH（16），CMA 結果分別為16q21q24.3 區域24.45 Mb和16p13.3 區域5.91 Mb 雜合性缺失；1 例LOH（20），芯片結果為20P12.3P11.1 區域20.91 Mb 及20q11.21q13.33 區域29.06 Mb 雜合性缺失，進一步家系驗證，結果為父源性UPD。

2.3 RATs 高風險孕婦的妊娠結局在182 例RATs 高風險的孕婦中獲得121 例詳細隨訪信息，在不考慮單個染色體的情況下，121 例孕婦中有46 例（38.02%）發生不良妊娠，主要表現在FGR 和PTB，發生率分別為25.62%（31/121）和20.66%（25/121），明顯高于以往報道（6.39%和7.1%）［6-7］。值得關注的是，我們發現不良妊娠的發生率在不同染色體之間存在差異，例如在1、2、3、6、15、16、22 號染色體上較高（≥50%），而5、14、17 號染色體沒有發生。其次，16 號染色體的病例數較多且不良妊娠特征較為明顯，發生率高達89.5%（17/19），19例孕婦中9 例（47.4%）出現早產，12 例（63.2%）出現FGR，見表2、3。

表2 121 例RATs 高風險孕婦的妊娠結局Tab.2 Pregnancy outcomes of 121 pregnant women at high risk of RATs 例

表3 孕婦的妊娠結局在不同染色體上的分布Tab.3 Distribution of pregnant women＇s pregnancy outcomes on different chromosomes 例

3 討論

與傳統的血清學篩查相比，NIPT 以其無創性、高準確性和妊娠范圍廣等優勢快速成為一種常見的產前篩查方式［8］，對21、18 和13 號染色體非整倍體的篩查具有較高的敏感性和特異性［9-10］，然而針對RATs 的數據量很少，臨床處理需要更多的數據支持。VAN 等［11］發現RATs 作為一個群體比T13 更常見，幾乎和T18 一樣常見，但是NIPT 檢測RATs 的準確性以及RATs 高風險與不良妊娠結局的相關性具有不明確性［12］，孕婦需要在侵入性產前診斷的已知風險和妊娠結局的未知影響之間進行權衡，導致遺傳咨詢充滿挑戰。因此，我們對此類數據進行研究，有助于改善妊娠管理。

本研究發現，NIPT 樣本中RATs 的頻率為0.21%，最常見是T7、T8、T16 和T20，這與BENNP等［13］的觀察相似，PPV 分別為3.13%、0.00%、12.5%和0.00%，總PPV 僅為5.15%。PPV 較低的原因：（1）染色體異常僅發生在胎盤而不發生在胎兒，稱為CPM［14］。在細胞發育過程中，由于有絲分裂或者減數分裂發生錯誤導致合子形成染色體三體，這在懷孕早期是致命的，只有合子發生“三體挽救”形成CPM，大部分胎兒才能繼續存活［15-16］。QI 等［17-18］發現，T7、T8 病例伴隨正常的羊膜腔穿刺術幾乎可以肯定地解釋為CPM。（2）合子發生三體挽救時，3 條染色體中的每一條都有同樣的丟失機會，如果剩下的兩條染色體來自同一個親本，就會產生UPD，UPD 不涉及染色體劑量的增加，NIPT 很難檢測到，但是6、7、11、14、15 或20 號染色體上的印記基因會產生不良臨床后果［19-20］。在我們的研究中發現了2 例UPD，1 例母源性UPD（6），尚無明確印跡疾病，孕婦選擇繼續妊娠；1 例父源性UPD（20），與假性甲狀旁腺功能減退癥相關［21］，孕婦選擇引產。UPD 的檢出率分別為50%（1/2）和9.09%（1/11），見表4。由此可見，NIPT 檢測到的RATs 很可能是假陽性的，但是RATs 高風險導致患UPD 的風險增加，盡管沒有超聲異常，印跡基因的不利影響仍存在。因此，NIPT 提示6、7、11、14、15 或20 號染色體三體時，建議孕婦進行侵入性檢測，另一方面，如果不涉及印跡基因，應該謹慎使用侵入性手術，但考慮到TFM 的存在需要增強超聲隨訪。

表4 羊水細胞中UPD 的檢出率及臨床表現Tab.4 Detection rate of UPD in amniotic fluid cells and clinical manifestation 例

其次，NIPT 檢測的cffDNA 來源于絨毛滋養層細胞，在產前階段，“胎兒游離DNA”被稱為“胎盤游離DNA”或許更加準確［22］，cffDNA 作為一種新的生物標志物，可以預測胎盤的健康與疾病，RATs 高風險可能與胎兒宮內死亡、FGR 和胎兒畸形等妊娠結局相關［13，23］。在本研究中，121 例RATs 高風險的孕婦中有46 例（38.02%）發生不良妊娠，但是，大部分孕婦獲得了活產（95.87%），不良妊娠主要體現在FGR（25.62%）和PTB（20.66%）。此外，在后續的妊娠管理中對于不同的染色體很可能不同，1、2、3、6、15、16 和22 號染色體的不良妊娠發生率較高（＞50%），尤其是16 號染色體FGR 和PTB 顯著高于總體組。出現這種現象的主要原因是：NIPT 篩查發現的RATs 通常局限于胎盤，根據受累組織的分布，CPM 分為CPM 1、2、3 型。由于cffDNA 來源于滋養層細胞，因此，只有CPM 1和3 型可以被NIPT 識別。CPM 1 型主要導致自然流產或宮內死亡，CPM 3 型容易引起FGR、PTB 等不良結局。15 和16 號染色體主要在CPM 3 型中檢測到，因此出現了圍產期高比例的不良妊娠結局，對于與RATs 高風險的孕婦妊娠期間的管理應基于具體染色體［4，15，24-25］。由此可見，對于NIPT 篩查RATs 高風險的孕婦，盡管大部分獲得了活產，核型和CMA 結果也可能正常，但是患FGR 和PTB 的風險增加，需要進行連續地超聲檢查以監測胎兒的生長發育。

我們將85 525 例數據匯集在一起，以確定在RATs 中哪些染色體最常見，并回顧了妊娠結局，評估了受累染色體、真陽性和UPD 的存在。本研究的優勢：（1）數據量較大，分析了RATs 在各條染色體上的差異。我們發現不同染色體對妊娠管理的好處是不同的，比如16 號染色體和涉及印記基因的染色體。（2）獲得了較完整的產婦信息包括新生兒的發育情況，以便分析RATs 與妊娠結局的相關性，目前國內的文章因缺乏后續的隨訪或者樣本量較少而沒有這方面的研究，導致過度診斷，眾所周知，羊水穿刺術是存在流產和感染的風險，我們探討了是否需要進行這項檢查，幫助緩解孕婦的焦慮。本研究的局限：（1）無法獲得胎盤的遺傳學檢測。（2）個別染色體的病例數仍然較少，可能無法得出關于異常風險的結論，但是通過數據的不斷積累有助于之后的研究。

綜上所述，NIPT 篩查RATs 的PPV 較低，應謹慎使用侵入性檢測，但是如果涉及印跡基因，則建議進行侵入性手術。另一方面，RATs 高風險具有重要的臨床意義，它提示孕婦患FGR 和PTB 的風險增加，尤其是16 號染色體，需要增強超聲檢查以監測胎兒的生長發育。