H9N2亞型流感病毒感染過程中神經(jīng)介素B及受體對(duì)NF-κB信號(hào)通路泛素酶的調(diào)控

田世茂,萬乾暉,許曉東,孔迎迎,田 珂,唐鈺冰,陳吉龍,楊桂紅

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)閩臺(tái)動(dòng)物病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)屬于正黏病毒科流感病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒,其基因組含8個(gè)RNA片段,這些片段編碼至少10種蛋白,其具體數(shù)量取決于病毒毒株[1-4]。IAV基因組的分節(jié)段性使其在傳播過程中易發(fā)生基因重組或突變導(dǎo)致疫苗的免疫失效[5],從而為獸醫(yī)臨床防控該病毒帶來困難。IAV根據(jù)其表面HA和NA抗原不同,分為許多亞型,截止到現(xiàn)在,已鑒定出HA有18種亞型,NA有11種亞型[6-9],其中,H9N2亞型在家禽中分布最廣泛,并為多種禽流感亞型提供基因片段[10-11],具有重要的公共衛(wèi)生意義。因此,本研究使用H9N2毒株感染宿主細(xì)胞,以宿主免疫因子NMB/NMBR為突破口,通過分析宿主NMB/NMBR先天性抗IAV/H9N2感染機(jī)制以期尋找更有效的新型抗病毒途徑。

神經(jīng)介素B(neuromedin B,NMB)是一種含有32個(gè)氨基酸的生物活性肽,可與其受體神經(jīng)介素B(NMBR)結(jié)合發(fā)揮多種生理功能[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),NMB/NMBR可以通過NF-κB信號(hào)通路參與抗IAV/H1N1的先天性免疫反應(yīng)[13-14]。但關(guān)于NMB/NMBR是如何介導(dǎo)IAV/H1N1感染誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路尚不明確。研究表明:IAV/H9N2感染后可刺激宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答[15-16],NF-κB信號(hào)通路作為先天免疫系統(tǒng)的重要一環(huán)被激活[17]。NF-κB信號(hào)通路激活過程中泛素化修飾發(fā)揮關(guān)鍵作用。病毒、白介素等刺激因素通過活化IκB激酶(IKK)激活下游抑制蛋白IκB釋放NF-κB蛋白。IKK復(fù)合體包括IKKα、IKKβ和NEMO[18-19]。NEMO蛋白的泛素化修飾是激活NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵過程,NEMO被泛素化后促進(jìn)IKK復(fù)合物的招募和活化[20-22]。IKK復(fù)合物是激活NF-κB的守門員,受到很多泛素蛋白酶調(diào)節(jié)[23],如:E3泛素連接酶RNF8泛素化修飾IKKα和IKKβ導(dǎo)致NF-κB激活過程被抑制[24];去泛素化酶CYLD通過去除NEMO的泛素化負(fù)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路;E3泛素連接酶MIB2則泛素化CYLD使其降解從而激活NF-κB信號(hào)通路[25]等。這些作用于IKK復(fù)合物節(jié)點(diǎn)的泛素蛋白酶對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活至關(guān)重要。本研究利用sh-NMBR細(xì)胞與NMB刺激的A549細(xì)胞,采用RT-PCR、qRT-PCR及Western blot技術(shù)探究NMB/NMBR如何調(diào)控IKK復(fù)合物節(jié)點(diǎn)的泛素蛋白酶從而影響IAV/H9N2感染誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路。該研究結(jié)果有助于理解NMB/NMBR對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用以及其參與發(fā)揮先天性抗流感病毒的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 人肺腺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)、人胚腎細(xì)胞(HEK293T細(xì)胞)購自美國ATCC細(xì)胞庫。H9N2(禽流感病毒H9N2)毒株為本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定后保存。

1.1.2 質(zhì)粒 pLP(pVSV-G)、pLP1、pLP2、pSIH-HI-GFP質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。本課題組前期利用pSIH-HI-GFP載體構(gòu)建重組sh-NMBR質(zhì)粒,并保存于本實(shí)驗(yàn)室。NMBR干擾細(xì)胞系(sh-NMBR細(xì)胞)構(gòu)建試驗(yàn)中使用sh-luciferase質(zhì)粒構(gòu)建對(duì)照組細(xì)胞(sh-luciferase細(xì)胞)。

1.1.3 引物序列 引物序列的合成由上海生工公司完成,具體序列信息見表1。

表1 RT-PCR和qRT-PCR引物Table 1 All primers used for RT-PCR and qRT-PCR

1.1.4 多肽合成 本研究中使用的多肽由中國杭州專肽生物技術(shù)有限公司合成,合成的多肽使用PBS溶解為100 μmol·L-1的濃度,分裝保存在-80 ℃?zhèn)溆谩MB氨基酸序列:Ala-Pro-Leu-Ser-Trp-Asp-Leu-Pro-Glu-Pro-Arg-Ser-Arg-Ala-Gly-Lys-Ile-Arg-Val-His-Pro-Arg-Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2。

1.1.5 主要試劑 瓊脂粉、酵母提取物、蛋白胨購自O(shè)xoid公司。胎牛血清購自Gibco公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipo8000購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自Tiangen公司。NucleoZol RNA 提取試劑購自上海基因生物技術(shù)國際貿(mào)易有限公司。RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒購自上海近岸科技有限公司。NC膜購自Millipore公司。tECL化學(xué)發(fā)光顯色液購自蘇州新賽美生物科技公司。Anti-NMBR(貨號(hào):ab134141)購自Abcam公司。Anti-P65(貨號(hào):8242)、Anti-p-P65(貨號(hào):3033)購自Cell Signaling Technology公司。兔抗鼠、鼠抗兔IgG二抗購自Jackson Immunoresearch公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇 將液氮凍存的細(xì)胞放入37 ℃水浴鍋內(nèi)快速搖晃直至解凍;轉(zhuǎn)移至含有2 mL完全培養(yǎng)基的15 mL滅菌離心管,吹打混勻,800 r·min-1離心5 min;棄上清;繼續(xù)加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀;轉(zhuǎn)移到含有7 mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中輕輕搖勻,置于37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 sh-NMBR細(xì)胞系的構(gòu)建 將HEK 293T細(xì)胞鋪于100 mm培養(yǎng)皿,待細(xì)胞生長到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染體系分為對(duì)照組:750 μL轉(zhuǎn)染液+24 μL Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑+8 μg sh-Luciferase質(zhì)粒+8 μg包裝質(zhì)粒:pLP(pVSV-G)、pLP1和pLP2;試驗(yàn)組:750 μL轉(zhuǎn)染液+24 μL Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑+8 μg sh-NMBR重組質(zhì)粒+8 μg包裝質(zhì)粒;將上述混合液沿皿壁加到已更換新鮮培養(yǎng)基的HEK 293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中并搖勻,放入置于37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);轉(zhuǎn)染48 h后收集上清,將上清液經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾;用過濾后的轉(zhuǎn)染上清液重懸提前消化于15 mL離心管的A549細(xì)胞,均勻地鋪在6孔板中,避光滴加與細(xì)胞懸液1∶1 000比例的polybrene,使用水平離心機(jī)懸浮感染120 min(2 100 r·min-1,32 ℃);細(xì)胞懸浮感染結(jié)束后,補(bǔ)加500 μL完全培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后可進(jìn)行細(xì)胞傳代。使用倒置熒光顯微鏡(Nikon Ti-E)觀察細(xì)胞熒光,觀察轉(zhuǎn)染效率,再用RT-PCR或Western blot檢測(cè)目的基因的干擾效果,最終可獲得具有穩(wěn)定干擾NMBR基因表達(dá)的細(xì)胞系(sh-NMBR細(xì)胞)。

1.2.3 病毒感染 A549細(xì)胞或sh-NMBR細(xì)胞生長到80%后,棄完全培養(yǎng)基(使用NMB刺激時(shí),需提前12 h加入100 nmol·L-1的NMB),PBS清洗兩次,加入1 mL維持液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+雙抗+2 mL胰酶);每孔加入適量病毒后置于培養(yǎng)箱吸附1 h,每15 min搖一次;吸附1 h后,棄維持液,PBS清洗兩次,加入2 mL新鮮的維持液,放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中,在攻毒后0、6和12 h收樣。

1.2.4 RT-PCR和qRT-PCR 使用NucleoZol提取細(xì)胞RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用NCBI數(shù)據(jù)庫在線引物設(shè)計(jì)工具Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物,具體引物序列見表1。

RT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 55～60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,共20～35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后,取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析目的條帶。

qRT-PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 30 s; 94 ℃ 5 s, 62 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s, 共40個(gè)循環(huán);72 ℃ 30 s;反應(yīng)結(jié)束后以GAPDH作為內(nèi)參,3次重復(fù)數(shù)據(jù)取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 Western blot 提取細(xì)胞樣品蛋白,用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上;將NC膜置于5%牛奶中封閉2 h, 1×TBS中漂洗干凈,一抗孵育2～3 h (Anti-NMBR購自Abcam公司,貨號(hào):ab134141;Anti-P65購自Cell Signaling Technology公司,貨號(hào):8242;Anti-Phospho-p65(pP65) 購自Cell Signaling Technology公司,貨號(hào):3033; Anti-GAPDH購自TransGen biotech公司,貨號(hào):HC301-01; Anti-NP 由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存),孵育結(jié)束后,用1×TBS漂洗30 min,每10 min換一次新的TBS;再用二抗孵育2 h(鼠抗兔IgG購自Jackson ImmnoResearch 公司,貨號(hào):211-005-109),1×TBS漂洗30 min,每10 min換1次TBS,將條帶置于tECL化學(xué)發(fā)光液(蘇州新賽美生物科技公司)后放入化學(xué)發(fā)光儀(Tanon 5200)曝光。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以上相關(guān)試驗(yàn)均進(jìn)行3次以上獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn),運(yùn)用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析差異顯著性。其中,*.P<0.05表示有差異;**.P<0.01表示差異顯著;***.P<0.001;****.P<0.000 1表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 干擾NMBR后促進(jìn)流感病毒H9N2亞型NP蛋白的表達(dá)

為明確NMBR對(duì)甲型流感病毒感染的調(diào)節(jié)作用,本試驗(yàn)用IAV/H9N2亞型感染sh-NMBR細(xì)胞,收集0、6和12 h的RNA樣品和蛋白樣品,分別采用RT-PCR、qRT-PCR和Western blot分析細(xì)胞中NMBR和NP的表達(dá)變化(圖1)。

A. RT-PCR分析IAV/H9N2感染的sh-NMBR細(xì)胞中的NMBR和NP轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化;B和C. qRT-PCR分析各組NMBR和NP表達(dá);D.Western blot分析各組NMBR和NP蛋白的表達(dá)水平;*. P<0.05;**.P<0.01; ****. P<0.000 1A. RT-PCR analyzed the transcript levels of NMBR and NP in sh-NMBR cells after IAV/H9N2 infection; B and C. qRT-PCR analyzed the expression levels of NMBR and NP in sh-NMBR cells after IAV/H9N2 infection; D. Western blot analyzed the expression levels of NMBR and NP in sh-NMBR cells after IAV/H9N2 infection; *. P<0.05;**.P<0.01; ****. P<0.000 1圖1 分析IAV/H9N2感染的各組sh-NMBR細(xì)胞中NMBR和NP的表達(dá)變化Fig.1 Analysis the expression levels of NMBR and NP in sh-NMBR cells after IAV/H9N2 infection

如圖1所示:與各時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組細(xì)胞相比,H9N2感染sh-NMBR細(xì)胞誘導(dǎo)NMBR的表達(dá)水平下降(6 h,P<0.01;12 h,P<0.05)和NP(6、12 h,P<0.000 1)的表達(dá)水平上升;同時(shí),H9N2感染sh-NMBR細(xì)胞誘導(dǎo)6和12 h的NMBR蛋白和NP蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)出與轉(zhuǎn)錄水平相同的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明,NMBR可調(diào)節(jié)IAV/H9N2 亞型NP的表達(dá)。

2.2 NMBR對(duì)IAV/H9N2感染誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路中泛素蛋白酶的變化

收集IAV/H9N2感染的sh-NMBR細(xì)胞0、6和12 h的樣品,分別采用RT-PCR、qRT-PCR和Western blot分析與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的RNF8、CYLD、MIB2和P65磷酸化水平的變化。如圖2所示:與對(duì)照組相比,IAV/H9N2感染的sh-NMBR細(xì)胞中RNF8(6 h,P<0.05;12 h,P<0.001)和CYLD(6 h,P<0.000 1;12 h,P<0.01)轉(zhuǎn)錄水平上升,MIB2(6 h,P<0.000 1;12 h,P<0.000 1)轉(zhuǎn)錄水平下降,P65磷酸化水平下降。以上結(jié)果表明,NMBR通過調(diào)控RNF8、CYLD和MIB2的表達(dá)而影響P65蛋白的活性,暗示了NMBR對(duì)IAV/H9N2感染誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

A. RT-PCR分析感染IAV/H9N2的NMBR干擾細(xì)胞中RNF8、CYLD和MIB2轉(zhuǎn)錄水平的變化;B～D. qPCR分析感染IAV/H9N2的NMBR干擾細(xì)胞中RNF8、CYLD和MIB2的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量;E. Western blot分析感染IAV/H9N2的NMBR干擾細(xì)胞中P65磷酸化水平;*. P<0.05;**.P<0.01; ***. P<0.001;****. P<0.000 1A. RT-PCR analyzed the transcript levels of RNF8, CYLD and MIB2 in sh-NMBR cells after IAV/H9N2 infection;B-D. qRT-PCR analyzed the transcript levels of RNF8, CYLD and MIB2 in sh-NMBR cells after IAV/H9N2 infection; E. Western blot analysis of the expression levels of P65 phosphorylation in sh-NMBR cells after IAV/H9N2 infection; *. P<0.05; **.P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1圖2 分析IAV/H9N2感染的各組sh-NMBR細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路上相關(guān)的泛素蛋白酶與P65磷酸化水平的表達(dá)變化Fig.2 Analysis the levels of the ubiquitination ligases and P65 phosphorylation related with NF-κB signaling pathway in sh-NMBR cells after IAV/H9N2 infection

2.3 NMB對(duì)IAV/H9N2感染A549細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的泛素蛋白酶的表達(dá)的影響

為進(jìn)一步確認(rèn)NMBR對(duì)NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)的泛素蛋白酶(RNF8、CYLD和MIB2)的表達(dá)影響,本研究選用外源合成的NMB(100 nmol·L-1)作為A549細(xì)胞中NMBR表達(dá)的激活劑,分別采用RT-PCR、qRT-PCR以及Western blot分析IAV/H9N2感染誘導(dǎo)的RNF8、CYLD、MIB2和P65磷酸化水平的表達(dá)變化。如圖3所示:與對(duì)照組相比,NMB成功刺激NMBR表達(dá)后可明顯促進(jìn)IAV/H9N2感染的細(xì)胞中RNF8(P<0.05)和CYLD(P<0.01)轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào),MIB2轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)和P65磷酸化水平的上調(diào)。以上結(jié)果表明,外源性NMB刺激細(xì)胞中NMBR表達(dá)后通過調(diào)控RNF8、CYLD和MIB2的表達(dá)而影響P65蛋白的活性,暗示NMB可通過NMBR參與調(diào)節(jié)IAV/H9N2感染誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的活性。

A. RT-PCR分析NMB處理與感染IAV/H9N2后各組RNF8、CYLD和MIB2轉(zhuǎn)錄水平的變化;B～D. qPCR分析各組RNF8、CYLD和MIB2的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量;E. Western blot分析各組P65磷酸化水平; ns. P>0.05; *. P<0.05;**.P<0.01A. RT-PCR analyzed the transnational levels of RNF8, CYLD and MIB2 in NMB treating A549 cells after IAV/H9N2 infection;B-D. qRT-PCR analyzed the transnational levels of RNF8, CYLD and MIB2 in NMB treating A549 cells after IAV/H9N2 infection; E. Western blot analysis of the expression levels of P65 phosphorylation in NMB treating A549 cells after IAV/H9N2 infection; ns. P>0.05; *. P<0.05; **.P<0.01圖3 分析IAV/H9N2感染的各組NMB處理A549細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的泛素蛋白酶與P65磷酸化水平的表達(dá)變化Fig.3 Analysis the levels of the ubiquitination ligases and P65 phosphorylation related with NF-κB signaling pathway in NMB treating A549 cells after IAV/H9N2 infection

3 討 論

本課題組前期研究表明,NMB/NMBR通過調(diào)控宿主的IL-6和IFN-α基因發(fā)揮抗H1N1/PR8感染的作用[13],并已證明IAV/H1N1感染誘導(dǎo)的NMB和NMBR可通過NF-κB信號(hào)通路參與機(jī)體發(fā)揮抗IAV感染的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)[14],但NMBR調(diào)控甲型流感病毒感染激活的NF-κB信號(hào)通路的作用機(jī)制尚不明確。NF-κB信號(hào)通路是病毒感染激活機(jī)體發(fā)揮先天免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要信號(hào)通路[26-27],而泛素化修飾在NF-κB信號(hào)通路的激活過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[28]。NF-κB蛋白由p65和p50構(gòu)成同源/異源二聚體,未激活時(shí)NF-κB二聚體被結(jié)合在抑制IκB蛋白,這種結(jié)合使NF-κB信號(hào)通路的活性被抑制[29]。研究表明,病毒和白介素等刺激因素通過IKK復(fù)合物活化IκB蛋白,磷酸化的IκB蛋白進(jìn)而被泛素化修飾后降解,釋放出有活性的NF-κB蛋白[18],進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄進(jìn)程。IKK復(fù)合物包括3個(gè)重要的成員:兩個(gè)激活酶活性催化蛋白IKKα、IKKβ和調(diào)控蛋白NEMO[30]。IKK被激活后NEMO發(fā)生泛素化,促進(jìn)IKK復(fù)合物的招募和活化,而IKK活化后就會(huì)刺激IκBα被泛素化修飾降解,釋放NF-κB二聚體,激活NF-κB信號(hào)通路[18,31]。因此,IKK復(fù)合物是NF-κB信號(hào)通路上的重要節(jié)點(diǎn),針對(duì)該節(jié)點(diǎn)的泛素化修飾值得深入研究。E3泛素連接酶RNF8已被證明可以特異性地泛素化IKK亞基IKKα和IKKβ,抑制其激活下游分子的能力,從而抑制NF-κB信號(hào)通路[24]。泛素化是一種可逆反應(yīng),可通過去泛素化酶(DUB)解除泛素化修飾,CYLD可以解除NEMO的泛素化,負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路,然而E3泛素連接酶MIB2又可以促進(jìn)CYLD降解從而激活NF-κB信號(hào)通路[25]。這些研究暗示與IKK復(fù)合物密切相關(guān)的泛素蛋白酶對(duì)NF-κB信號(hào)通路有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn),NMB和NMBR均可以調(diào)節(jié)IAV/H9N2感染誘導(dǎo)細(xì)胞中RNF8、CYLD和MIB2表達(dá),暗示NMB和NMBR通過調(diào)節(jié)作用于NF-κB信號(hào)通路IKK節(jié)點(diǎn)的E3泛素連接酶和去泛素化酶從而發(fā)揮抗IAV/H9N2感染誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本研究從泛素化修飾的角度分析NMB和NMBR調(diào)節(jié)甲型流感病毒感染的作用機(jī)制,為研究宿主-病毒之間的密切關(guān)系提供更充足的依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過體外試驗(yàn)的研究,揭示NMB/NMBR通過調(diào)節(jié)與IKK直接相關(guān)的多個(gè)泛素蛋白酶的表達(dá),參與IAV/H9N2亞型感染激活的NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。該研究結(jié)果表明,NMB/NMBR可通過泛素化修飾調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的活性,參與機(jī)體發(fā)揮抗IAV感染的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng),為深入了解宿主抗IAV感染的作用機(jī)制和開發(fā)新型抗IAV藥物提供更充足的理論依據(jù)。