駱駝源性標準物質研制工藝優化及性能評價

汪星宇 邢圓瑩 徐香富 伍志強 李娟 郭俊利 馬 滎 施蕊 何霞紅 季超 鄭文杰

摘要：為了得出駱駝源性標準物質研制工藝的最佳組合，通過對經真實性鑒定的駱駝肉的切肉形狀（片狀、條狀和塊狀）、蒸制時間（0、20、30、40?min）與干燥工藝（冷凍干燥、40、50、60?℃）3個關鍵標準物質研制工藝參數進行優化，以成粉率為考核指標，并以《常見畜禽動物源性成分檢測方法?實時熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）中駱駝源性成分實時熒光多聚核苷酸鏈式反應（Real-time?Polymerase?Chain?Reaction，PCR）鑒定方法進行脫氧核糖核酸（Deoxyribo?Nucleic?Acid，DNA）測試，檢驗標準物質的穩定性與均勻性，確定了條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm），隔水蒸制30?min后在50?℃下烘干后成粉率最高，達到了93.72%，且研制的駱駝源性標準物質均一性和穩定性均經F檢驗，無顯著差異。該研究所建立的駱駝源性標準物質研制工藝，成粉率高且均一，為高脂肪類樣品成粉的研究提供借鑒，為動物源性標準物質提供了研制工藝和技術參數，且研制的駱駝源性成分定性標準樣品達到國家標準樣品的技術要求，可用于對食品中駱駝源性成分檢測過程的方法驗證與質量控制等活動。

關鍵詞：標準物質??駱駝肉??研制工藝??響應面??性能評價

中圖分類號：TS254.4??文獻標識碼：AOptimization?and?Performance?Evaluation?of?the?Development?Process?of?Camel-Derived?Reference?MaterialsWANG?Xingyu1??XING?Yuanying1??XU?Xiangfu1??WU?Zhiqiang1??LI?Juan1??GUO?Junli1??MA?Ying1??SHI?Rui2??HE?Xiahong2??JI?Chao1??ZHENG?Wenjie1*

Key?Words：?Reference?materials;?Camel?meat;?Development?process;?Response?surface;?Performance?evaluation

駱駝在動物學分類中歸屬于哺乳綱（Mammalia）、偶蹄目（Artiodactyla）、駝科（Camelidae）、駝屬（Camelus），其駱駝肉具有高水分、高蛋白、低脂肪及低膽固醇等特點[1-3]，具有一定的藥用和保健價值，對呼吸系統疾病、胃酸過多、高血壓及肺炎等疾病均有療效[4]。而目前針對駱駝源性成分檢測的標準包括2項國家標準、2項行業標準和1項地方標準，即《常見畜禽動物源性成分檢測方法?實時熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）、《動物源性飼料中駱駝源性成分定性檢測方法?PCR方法》（GB/T?21100-2007）、《出口食品及飼料中動物源成分快速檢測方法?第4部分：駱駝成分檢測?PCR-試紙條法》（SN/T?5145.4-2019）、《出口食品中駱駝源性成分的檢測?實時熒光PCR法》（SN/T?4418-2016）和《駱駝源性成分檢測方法?實時熒光PCR法》（DB15/T?2026-2020），但尚未有相對應的標準物質來質控檢測過程。

而在食品安全檢測體系中，標準物質對整個檢測質量控制體系起到核心作用，在實物標準樣品研制過程中對于樣品均一性也有著嚴格要求[5]，所以成粉工藝對于實物標準物質的研制也是不可或缺的。同時，“十四五”規劃中明確提出健全國家標準樣品管理機制，完善協調配套的國家標準樣品體系[6]，現有的標準樣品涉及金屬[7]、農殘[8]、微生物[9]等領域的研制，缺乏動物源性成分的實物標準樣品的研制。目前，針對肉類加工工藝的研究有中華鱘[10]、雞肉[11]、鵝[12]等物種，加工工藝的因素有蒸煮時間、烘烤溫度[13-14]等條件，干燥工藝方法的研究有微波干燥、紅外干燥、烘箱、烤箱等[15-17]，但這些研究未對肉粉加工工藝有系統性的最優條件比較，且未有研究對駱駝源性標準物質的成粉工藝進行探討。

因此，該研究針對上述問題，在已有研究的基礎上[18]，首先通過動物源性鑒定通用引物對駱駝鮮肉進行分子鑒定，然后針對切肉形狀、蒸制時間與烘干溫度3個關鍵標準樣品研制工藝參數進行單因素和響應面優化，并以成粉率和脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic?Acid，DNA）擴增效率為考核指標，進一步評價研制駱駝源性標準物質的均一性和穩定性，以期為駱駝源性成分實物標準物質的均一性研制提供實驗基礎，來填補動物源性標準物質研制領域的空白。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

該研究所用的駱駝肉實驗材料購自電商平臺，參考標準《動物制品中動物源性檢測基因條碼技術Sanger測序法》（GB/T?35918-2018）通過了駱駝肉真實性檢驗。

0.5?mol/L?乙二胺四乙酸（Ethylene?Diamine?Tetraacetic?Acid，EDTA）、1?mol/L?三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（Tris?hydrochloride，Tris-HCI）、20%十六烷基硫酸鈉（Sodium?Dodecyl?Sulfate，SDS）；氯化鈉、磷酸氫二鈉（分析純）；磷酸二氫鈉、無水乙酸鈉、異丙醇（分析純）；無水乙醇（分析純）；蛋白酶K（20?mg/mL）、RNA酶（10?mg/mL）、DL1000?DNA?Marker、6×Loading?Buffer、TB?Green?Premix?Ex?Tag?Ⅱ（Tli?RNaseH?Plus）；TE緩沖液（Tris-EDTA?buffer?solution，TE?buffer）；Ultra?GelRed（10，000×）；50×TAE緩沖液；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2?儀器與設備

單罐行星式球磨機（Pulverisette?6型）；熒光定量聚合酶鏈反應（Polymerase?Chain?Reaction，PCR）檢測系統（NOVO?Max100）；高速冷凍離心機（3K15型）；粉碎機（FSJ-A03E1）；SOP電子分析天平（精度0.001?g）；干燥箱（DHG-9031A）；梯度PCR儀（T100）；體式熒光顯微鏡（SMZ25）。

1.3?實驗方法

1.3.1?研制工藝單因素優化

針對駱駝肉樣的物理形態、蒸制時間、干燥工藝分別設計了3個梯度分組實驗。將物理形態分為片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）、條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）、塊狀（1?cm×1?cm×1?cm）；蒸制時間設定為0、20、30和40?min；干燥工藝分為冷凍干燥，及烘干溫度40、50、60?℃，樣品達到恒重后經球磨儀3?000?r/min，5?min的研磨，后過80目篩（粒徑小于0.1?mm），通過成粉率進行研制工藝優化。每個處理重復10次。

1.3.2?研制條件優化響應面分析

運用Design-Expert軟件，針對物理形態（片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）、條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）、塊狀（1?cm×1?cm×1?cm）、蒸制時間（20、30和40?min）、烘干溫度（40、50和60℃）這3個因素，進行響應面實驗設計，確定最佳工藝參數組合，并參照《肉松質量通則》（GB/T?23968-2022）進行感官評價篩選（表1）。

1.3.3?駱駝源性標準物質均一性檢驗

標準物質均勻一性是對標準樣物的特性量值在空間分布的均勻程度的評價，是標準樣品的重要質量指標之一[19]。參照《標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統計方法》（GB/T15000.3-2008）規定，從同一批次制備的駱駝源性標準物質中隨機抽取9瓶，依據《常見畜禽動物源性成分檢測方法?實時熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）中建立的駱駝源性成分實時熒光PCR鑒定方法進行均一性檢驗。

1.3.4?駱駝源性標準物質穩定性檢驗

在適宜的儲存條件下，標準物質的特性值在較長的一段時間內沒有發生顯著變化，即標準物質的穩定性良好[20]。參照《標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統計方法》GB/T15000.3-2008規定，對標準物質進行兩年的穩定性跟蹤測定，將標準物質貯存在0～4℃低溫條件下保存，分別在第一年的每2個月、第二年的每3個月隨機抽取2瓶樣品，采用《常見畜禽動物源性成分檢測方法?實時熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）中的方法進行檢測，依據實時熒光PCR擴增結果和Ct值分析駱駝源性標準物質穩定性。

1.4?數據處理

實驗數據記錄在Office?2016中，并以平均值±標準偏差表示，同時進行Duncan方差分析（P=0.05），以小寫字母表示因素之間的顯著性。響應面數據和統計分析在Design-Expert?10軟件進行。

2?結果與分析

2.1?研制工藝單因素優化

由圖1（a）可知，蒸制時間為30?min時過篩量更高，成粉率為（84.41±3.74）%；以條狀肉蒸制30?min后進行干燥工藝（凍干、40、50、60℃）的優化，結果如圖1（b0所示，鼓風干燥的溫度為50?℃時成粉率為（82.63±2.71）%，更有助于駱駝肉成粉。研究表明，過高的溫度和較長的處理時間會降低肉粉中氨基酸的消化率[21]，將真實性鑒定合格的駱駝鮮肉分割為片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）、條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）、塊狀（1?cm×1?cm×1?cm）不同的物理形態，以30?min的蒸制條件和50?℃的烘制條件進行處理，烘干完全后研磨過80目篩后，計算成粉率，由圖1（c）可知，將肉切成條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）成粉率為（80.89±3.64）%，結果顯著高于片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）和塊狀（1?cm×1?cm×1?cm）；綜上，單因素優化結果中，最佳物理狀態為條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm），最佳蒸制時間為30?min，最佳干燥工藝是鼓風干燥50?℃。

2.2?駱駝肉粉工藝響應面優化

通過單因素試驗確定的最佳實驗條件進行響應面實驗，條件如下：物理狀態（A）（片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）、條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）、塊狀（1?cm×1?cm×1?cm））、蒸制時間（B）（20、30和40?min）、烘干溫度（C）（40、50和60℃），進行三因素三水平設計，如表2所示，并根據設計組進行實驗，表3為不同響應面條件下得到的過篩率，表4表明模型整體極顯著（P<0.01），失擬項不顯著，R2=0.061?7，模型整體擬合較好，其中一次項：物理形狀和干燥溫度影響顯著，蒸制時間影響極顯著；交互項之間影響不顯著。根據模型擬合結果，預測理想條件下的最佳條件為條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm），蒸制時間32.019?1?min，烘干溫度為46.465?9?℃，根據響應面試驗預測結果結合實際條件確定最佳標準物質研制成粉工藝參數為：駱駝肉切成條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm），蒸制30?min后以50?℃烘干，研磨過篩，經體式顯微鏡觀察駱駝成粉的粉末均勻（見圖2）；但也觀察粉末之間由于靜電吸附存在結團現象，針對此現象，后續有待進一步研究如何消除粉末之間的靜電作用。

2.3?感官評價

從顆粒形態與大小、色澤、氣味和是否存在雜質等5個方面對不同研制工藝形成駱駝肉粉進行顯微觀察（見圖3）和感官評定，滿分以100分計。在室溫（25?℃）下由10人成立的固定評定小組，參照表1進行感官評定。結果如表7所示，第5組響應面條件的感官評價結果最佳的，與響應面結果是一致的。

圖3??駱駝肉粉響應面結果顯微圖

表5??感官評定結果

序號

顆粒形態

顆粒大小

色澤

氣味

雜質

綜合評分

1

26

24

16

10

9

85

2

28

26

18

10

10

92

3

30

28

18

10

9

95

4

20

22

18

10

10

80

5

28

28

18

10

10

94

6

22

24

18

10

10

84

7

28

26

18

10

10

92

8

18

22

16

10

10

76

9

28

26

16

10

8

88

10

28

24

20

10

9

91

11

24

28

16

10

10

88

12

28

26

18

10

10

92

13

28

26

18

10

10

92

14

25

28

18

10

10

91

15

16

22

16

10

10

74

16

24

30

18

10

9

91

17

28

26

18

10

10

92

2.4?駱駝源性標準物質均勻性檢驗

參照標準GB/T?38164-2019中的方法進行實時熒光PCR檢測，并根據擴增曲線和Ct值判定結果。在陽性對照和陰性對照均正常的情況下，Ct值≥40，可判斷該基因擴增結果為陰性；Ct值＜35，可判斷該基因擴增結果為陽性，如表6所示，結果表明，經F檢驗，計算F統計量為0.128?7，小于F（8，18）=2.510?1，且P值不顯著，說明研制的駱駝源性標準物質是均勻的。

2.5?駱駝源性標準物質儲存穩定性檢驗

在適宜的保藏條件下，標準樣品物質的穩定性應不會隨著貯存時間、運輸時間的延長發生顯著變化。參照《標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統計方法》（GB/T15000.3-2008）規定，對標準樣品物質進行兩年的穩定性跟蹤測定，將標準樣品物質貯存在0～4?℃低溫條件下保存，分別在第一年的每2個月、第二年的每3個月隨機抽取23瓶樣品，采用《常見畜禽動物源性成分檢測方法?實時熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）中的方法進行檢測，依據實時熒光PCR擴增結果和Ct值分析駱駝源性標準樣品物質儲存穩定性。如表7所示，結果表明，經F檢驗，計算F統計量為1.156?1，小于F（9，20）=2.392?8，且P值不顯著，表明研制的駱駝源性標準物質儲存在0～4?℃低溫條件下是穩定的。

3?結論

該研究為實現將駱駝肉研制成均勻分散的駱駝粉，對駱駝源性標準物質研制的工藝進行研究，通過優化制粉的物理狀態、蒸制時間及烘干溫度，并以成粉的粒徑為考核指標，探討均勻分散的駱駝源性標準物質成粉工藝，同時也驗證了研制的駱駝源性標準物質的均一性和穩定性，表明該研究所研制的駱駝源性標準物質可用于相關標準的實物參考，該研究結果為高脂肪類樣品成粉的研究提供借鑒，為動物源性標準物質提供了研制工藝和技術參數，填補了動物源性標準物質研制領域的空白。

參考文獻[1]?LAMYAA?M?A.Discrimination?of?Pork?Content?in?Mixtures?with?Raw?Minced?Camel?and?Buffalo?Meat?Using?FTIR?Spectroscopic?Technique[J].American?Astronomical?Society，2013，42（3）：224.

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