26個香菇菌株的遺傳多樣性ISSR分析

吳小燕, 鮑紅春, 李小雷, 于海濱, 王海霞, 于傳宗, 龐 杰, 王 鋒

(1.內蒙古農業大學農學院, 呼和浩特 010000; 2.內蒙古自治區農牧業技術推廣中心, 呼和浩特 010000;3.內蒙古自治區農牧科學院, 呼和浩特 010000;4.鄂爾多斯市東勝區罕臺鎮社會治理綜合服務中心, 內蒙古 鄂爾多斯 017000)

香菇[Lentinulaedodes(Berk.) Pegler]隸屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、口蘑科、小香菇屬[1]。在我國南北方有不同的俗稱,北方多稱為香菇,南方又稱為香蕈、香信、冬菇、花菇等。香菇是一種傳統食、藥用菌,我國栽培時間久,現已成為我國栽培面積最大的食用菌之一,因其富含人體所需的膳食纖維、蛋白質、氧化酶和維生素等成分,具有很高的經濟、營養價值。另外,香菇中的香菇嘌呤、不飽和脂肪酸、維生素D原等藥用價值高,長期食用能夠增強人體免疫功能、預防心血管疾病、抗腫瘤、抗衰老,降低血脂[2]。目前香菇在實際生產中,品種是影響產量及品質的重要因素。近年來,雖然我國香菇育種工作發展迅速,培育出了一批質優、抗逆性強的優良品種,但地域小氣候會對香菇生長產生很大影響,現有優良品種不能完全滿足生產需求。內蒙古自治區香菇產業雖然栽培品種多,但大多數菌種都是從區外引進,真正具有自主知識產權,可用于大規模推廣的優良品種甚少。生產用菌種普遍退化、老化,綜合性狀差,生產效率低;菌種混雜、種源混亂不清問題嚴重。目前,內蒙古自治區西部地區栽培的主要菌株仍是808和9608,優良品種單一、出菇期相對集中,生產效益欠佳,優良菌株的篩選、鑒定及新品種選育工作迫在眉睫。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat,ISSR)分子標記是在Zitkiewicz等[3]的基礎上通過使用3′或5′錨定引物發展的一項技術。ISSR技術穩定、可重復、符合孟德爾遺傳規律、多為顯性標記、比其他分子標記更實惠、更有效,而且無須知道被測生物體的基因組序列。近年來,廣泛用于香菇的遺傳多樣性分析、品種鑒定、系統發育、連鎖圖譜的構建等研究[4],陳小敏等[5]通過ISSR分子標記技術對四川省收集的菌株進行聚類分析,說明四川省野生香菇資源遺傳多樣性豐富。宋瑩等[6]采用ISSR分子標記技術分析了遼寧省主栽的20個香菇菌株的遺傳差異性,為遼寧省香菇遺傳育種工作奠定了基礎。使用ISSR技術明確保存的香菇種質資源之間的親緣關系。本研究以區內外收集的26個香菇菌株為試驗材料,對26個香菇菌株進行ISSR分子標記分析,了解它們的親緣關系,為今后的香菇雜交育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

26個供試菌株來自全國不同育種機構,現保存于內蒙古自治區園藝研究院,其編號與來源見表1。

1.2 研究方法

1.2.1菌種活化

將實驗室4 ℃保存的香菇菌株取出,將各菌株的菌絲體在25 ℃條件下,置于直徑9 cm的培養皿中,培養7～10 d,收集菌絲[5-7]。

1.2.2DNA提取與檢驗

采用真菌基因組提取試劑盒(Biospin)從26份香菇菌絲中提取基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度,將基因組DNA稀釋至100 ng/μL,-20 ℃保存備用。

1.2.3ISSR分子標記引物

試驗所用引物來自參考文獻[8],由上海生工生物工程公司合成。引物具體信息如表2。

表2 ISSR引物產品信息Table 2 ISSR primer product information

1.2.4ISSR-PCR擴增

擴增體系(25 μL):稀釋后的ISSR引物和DNA模板各1 μL、12.5 μLTaqPCR Master Mix,剩余部分用ddH2O補齊。

擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,48 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,35個循環;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.5引物篩選

以菌株阜平XG-31和XG 168的DNA為模板,24對ISSR引物進行PCR擴增,擴增后選擇譜帶清晰且間距均勻,多態性強的引物。

1.2.6數據分析

讀取擴增電泳圖數據,同一遷移位點上清晰條帶記為“1”,無帶記為“0”,建立“0-1”矩陣[9-10]。使用PopGen 32軟件計算所有材料的等位基因數(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(Effective number of alleles,Ne)、基因多樣性指數(Nei’s gene diversity,H)、Shannon信息指數(Shannon’s Information,I)。運用統計分析軟件NTSYS-pc 2.10 e構建UPGMA聚類圖譜,計算Nei’s 遺傳距離(Nei’s genetic distance,D)[11-13]。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測結果

DNA電泳檢測結果(圖1)表明,各材料均出現了1條清晰、無拖尾的DNA條帶,這說明用試劑盒提取的DNA純度高,完整性好,無降解現象,能夠滿足后續實驗要求。

圖1 26個香菇材料基因組DNA純度檢測結果Fig.1 Genomic DNA purity test results of 26 Lentinula edodes materials

2.2 ISSR引物擴增結果

篩選出的10條引物在26個香菇菌株中共擴增出67條多態性片段(圖2、圖3),多態性比率為95.71%(表3)。每個引物擴增條帶范圍5～12條,平均每個引物7條。其中引物P 3和P 5分別擴增9條和12條條帶,是擴增條帶最多且多態性達到100%的引物;引物P 12和P 17擴增出的多態性條帶最少,只有4條,多態性為80%。綜合表明,26個香菇菌株具有豐富的遺傳多樣性。

圖2 引物P 1對部分香菇菌株擴增結果Fig.2 Primer P 1 amplification results of partial Lentinula edodes materials

圖3 引物P 17對部分香菇菌株擴增結果Fig.3 Primer P 17 amplification results of partial Lentinula edodes strains

表3 26份供試香菇材料的ISSR引物擴增結果Table 3 ISSR primer amplification results of 26 test Lentinula edodes materials

2.3 遺傳多樣性分析

26個供試菌株的有效等位基因數變幅介于1.630 6～1.958 0之間,均值為1.807 2,基因多樣性指數變幅介于0.387 9～0.489 3之間,均值為0.445 0,Shannon信息指數變幅介于0.576 4～0.682 4之間,均值為0.630 8(表4)。

表4 26份供試香菇材料的遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity analysis of 26 test Lentinula edodes materials

26個供試菌株的遺傳距離變幅介于0～0.749 9之間(表5),各材料間的遺傳差異較大。

表5 26份供試香菇材料的遺傳距離矩陣Table 5 Genetic distance matrix of 26 test Lentinula edodes materials

2.4 ISSR聚類分析

聚類分析圖結果(圖4)表明,26個菌株間的遺傳相似水平變化范圍在0.51～0.99之間,總體相似性為51%,相似系數越小,親緣關系越遠,遺傳多樣性越明顯。遺傳相似系數小于0.51時,所有的供試菌株聚為一類。其中,XG-Y和阜平香菇0912;HXG-8 L 1和慶元香菇;遵化香菇168和平泉香菇168之間的遺傳相似系數最大,表明遺傳相似程度最高,遺傳距離最近,遺傳相似系數達到0.99。在遺傳相似系數為0.678時將供試菌株分成4個類群,第一類群包括XG 168、MXG-4、XG-12、JXG-238、林西香菇、XG-Y、阜平香菇0912、MXG-1669、河南雨花、WYXG-215、冬香4號、冬香5號、香菇808、臺灣香菇60、HXG-8 L 1、慶元香菇、X-0912、MXG-148 abc、LXXG-1611、遵化香菇-808、平泉香菇-168、遵化香菇-168、阜平XG-31;第二類群由沁陽雨花組成;第三類群由靈仙香菇組成;第四類群由寶林2號組成。沁陽雨花、靈仙香菇、寶林2號與其他香菇菌株間親緣關系較遠。

圖4 26份香菇材料的ISSR遺傳關系聚類分析Fig.4 ISSR genetic relationship cluster plot of 26 Lentinula edodes materials

3 討論與結論

ISSR分子標記技術已廣泛用于香菇菌株的鑒定,為分子水平上識別鑒定菌株提供了技術支持。肖東來等[14]利用ISSR技術對17個栽培菌株和3個野生菌株進行遺傳多樣性研究發現,多態性條帶占90.82%。郭金英等[15]用6個引物對40個香菇菌株進行擴增,平均每條引物擴增的條帶數在10～15條之間。本試驗用10對引物對26個菌株進行擴增,每個引物擴增條帶5～12條,參試菌株多態性條帶占比為95.71%,這與肖東來等[14]、郭金英等[15]的研究結果一致,表明ISSR分子標記技術使用較少引物可獲得的多態性條帶較多。供試菌株遺傳距離變幅介于0～0.749 9之間,名稱相似或來自同一地區栽培的品種大多數會聚為一類,親緣關系較近。

在遺傳相似系數為0.99時,XG-Y和阜平香菇0912、HXG-8 L 1和慶元香菇、遵化香菇168和平泉香菇168親緣關系最近,在遺傳相似系數為0.678時將供試菌株分成4個類群,沁陽雨花、靈仙香菇、寶林2號各自為一個類群,與其他香菇菌株遺傳差異較大,可作為香菇品種選育的基礎材料。但其他23個菌株間遺傳相似系數高,說明供試菌株遺傳背景較單一。在今后的育種工作中,需收集更多優質菌株,拓寬遺傳基礎,通過育種材料合理配置,為香菇主栽品種的遺傳改良和培育具有自主知識產權的優良菌株奠定基礎。