鈣脅迫對黑骨藤種子萌發及幼苗生長的影響

姜曉琪, 楊榮藝, 李恒謙, 龍金蘭, 吳之坤

(1.貴州中醫藥大學, 貴陽 550025; 2.畢節市中藥研究所, 貴州 畢節 551700)

鈣是植物體內必需的營養元素,是組成植物細胞壁的重要組分,對植物的發育起著極其重要的作用,同時還能夠抵抗脅迫對植物造成的危害[1]。貴州屬于典型的喀斯特地貌,在喀斯特環境下,鈣離子過多會抑制植物的生長,同時還會影響農作物的產量等[2]。對于大多數的植物來說,種子萌發及幼苗生長期是其生長最脆弱的時期,在種子萌發以及幼苗期對脅迫環境適應能力的大小是決定其植物分布范圍及種群生存能力的關鍵性因素,高鈣的喀斯特特殊生境,可以促進植物的抗逆性特化發展[3]。因此,研究在貴州喀斯特地區生長的植物適應高鈣脅迫的機制具有重要意義。

黑骨藤為貴州少數民族地區苗族和布依族較為常用的藥物,其藥材來源于夾竹桃科(Apocynaceae)杠柳屬(Periploca)植物黑龍骨(PeriplocaforrestiiSchltr.)的全株,具有祛除風濕、活血化瘀、消炎、殺菌等功效,主要用來治療跌打損傷、風濕性骨痛和風濕性關節炎等疾病[4]。基于以上優點,以黑骨藤為主藥開發了黑骨藤追風活絡膠囊、黑骨藤伸筋透骨液、苗藥黑骨藤追風液等系列的產品,具有良好的發展前景。黑骨藤為多年生常綠藤本植物,其生長環境為海拔2 000 m以下陽光較為充裕的山坡雜林灌叢中,以及高山巖壁上,主要分布于貴州、廣西、四川、重慶、云南等地的喀斯特地貌環境下[5]。目前,黑骨藤多為野生品種,很少有人工種植栽培,國內外有關黑骨藤的研究主要集中在野生資源的化學成分、生藥學、質量控制、藥理作用以及臨床應用等方面[6-10],而在喀斯特環境下鈣脅迫對黑骨藤種子萌發及幼苗生長影響的研究尚未見報道。鑒于此,針對喀斯特地區土壤鈣離子濃度高的這一特點,以黑骨藤種子和幼苗期植株為研究對象,通過測定不同濃度CaCl2脅迫環境下黑骨藤種子和幼苗相關萌發指標、生長指標及生理指標,研究其對黑骨藤種子萌發及幼苗生長的影響,為今后黑骨藤的引種繁育研究提供一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

樣品經貴州中醫藥大學魏升華教授和吳之坤副教授鑒定為黑骨藤,于2020年11—12月,在貴州中醫藥大學資源圃(原植株引種于修文縣)采集黑骨藤種子進行相關研究實驗。種子采集后晾于通風處,進行除雜后備用。

1.2 方 法

1.2.1種子處理

黑骨藤種子除雜后置于3層濾紙的培養皿(直徑15 cm)作為發芽床,通過預實驗,每皿分別用純化水配制0,10,30,60,90,120 mmol/L的CaCl2溶液,以CaCl2濃度0 mmol/L為對照組。用5%次氯酸鈉對黑骨藤種子進行消毒,處理8 min后,再用蒸餾水沖洗種子數遍,然后放入發芽床中,每個處理75粒種子,3次重復,每2 d更換1次發芽床。于人工氣候箱內(25 ℃,光照16 h/黑暗8 h,相對濕度60%)連續培養,每天18:00時用注射針管定量加入CaCl2溶液。

發芽試驗期間每天定時觀測種子的萌芽狀況,種子萌發以胚根露出種皮1 mm為標志,記錄每個培養皿內種子萌發數和胚根胚軸的長度,萌發結束以萌發末期連續3 d萌發粒數不足供試種子總數的1%為標志。試驗處理35 d后測定種子萌發后幼苗的苗高、葉片數(新葉片數)、葉長/葉寬、根長、根粗、須根數等生長指標。

1.2.2幼苗處理

種子處理后置于人工氣候箱內(25 ℃,光照16 h/黑暗8 h,相對濕度60%)連續培養。種子露白后轉移至裝有已消毒土壤基質的育苗盤中進行培養備用,每天下午用純化水進行噴灑,育苗盤保持濕潤。經過實驗觀察,當育苗盤中的黑骨藤幼苗長出2～3對真葉后,將長勢一致的黑骨藤幼苗移栽至一個裝有混合土壤(V腐殖土∶V蛭石=2∶1)的花盆(直徑10.3 cm、高8.5 cm)中,用純化水一次性澆透,讓其在花盆中適應一周后,黑骨藤幼苗無萎黃的現象,長勢正常即可進行脅迫試驗。試驗前,分別配制濃度為10,30,60,90,120 mmol/L的CaCl2溶液,試驗時以澆純化水作為空白對照組,分別用不同比例的CaCl2溶液進行定期定時定量淋灑,每天18:00時用稱重法補至原始重量。

試驗處理45 d后測定幼苗株高、葉片數(新葉片數)、葉長/葉寬、根長、根粗、須根數等生長指標。采用紫外分光光度法測定過氧化物酶(POD)活性、可溶性糖含量,采用ELISA檢測試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用微量法測定谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性,采用分光光度法測定葉綠素含量。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2016軟件進行數據處理和作圖,使用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析及顯著性差異比較。

2 結果與分析

2.1 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤種子萌發指標的影響

由表1可知,隨著鈣脅迫濃度的增加,黑骨藤種子的發芽勢、發芽指數均呈降低趨勢;其萌發率在30 mmol/L以下時差異不顯著,30 mmol/L以上濃度其萌發率隨著濃度的增加顯著下降。對照組的發芽勢(44.44%)與萌發率(94.22%)均最高,對照組發芽勢與鈣濃度處理組相比,差異極顯著。120 mmol/L處理組萌發率最低,除與90 mmol/L差異不顯著外,與其他處理組均差異極顯著。從發芽指數方面看,對照組黑骨藤種子活力最高,與高濃度鈣處理組相比,差異極顯著;各處理組間的萌發歷期組間差異顯著。結果表明,除了萌發率在30 mmol/L以下表現出一定的耐受性之外,經不同濃度鈣處理,一定程度上會對黑骨藤種子萌發指標產生影響,抑制種子的萌發活力。

表1 不同濃度鈣脅迫對黑骨藤種子萌發特性的影響Table 1 Effects of different concentrations of calcium stress on the seed germination characteristic of P. forrestii

2.2 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤種子逐日萌發率的影響

由圖1可知,不同濃度鈣處理的黑骨藤種子的萌發高峰期存在差異,低濃度處理組(0～30 mmol/L)的萌發高峰期在第7～15天,高濃度處理組(60～120 mmol/L)的萌發高峰期在第19～28天,相比于低濃度處理組往后延遲了4～6 d。逐日萌發率較高的是對照組和10 mmol/L處理組,對照組的萌發高峰期在第8天,萌發率為14.67%,出現7個發芽波峰;而10 mmol/L處理組的萌發高峰期在第11天,萌發率為15.11%,出現8個發芽波峰;30 mmol/L的萌發高峰期在第12天,萌發率為12.44%,共出現7個發芽波峰;60,90 mmol/L處理組的萌發高峰期均在第24天,萌發率均為12.44%,發芽波峰分別為4個、6個;120 mmol/L處理組的萌發高峰期在第23天,萌發率為12.00%,發芽波峰有6個。隨著鈣脅迫濃度的增加,黑骨藤種子的逐日萌發率呈下降趨勢,且萌發高峰期持續時間也隨之降低,說明在高鈣脅迫環境下會抑制黑骨藤種子的萌發。

圖1 鈣脅迫對黑骨藤種子逐日萌發率的影響Fig.1 Effects of calcium stress on day-by-day germination rate of seed of P. forrestii

2.3 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤種子萌發后幼苗生長的影響

不同濃度鈣處理組ANOVA分析結果(表2)表明,對照組與各鈣濃度處理組的根長、根粗、須根數、莖長、葉長、葉寬、葉片數、苗高組間差異顯著。由表2可知,120 mmol/L處理組無真葉長出,而根長和根粗最大,說明高濃度鈣脅迫種子無法通過光合作用進行生長,只能借助胚根汲取發芽床水分進行生長,由于鈣濃度過高,胚根不斷伸長和膨大才能儲存足夠的水分。

表2 鈣脅迫處理35 d后黑骨藤幼苗的生長情況Table 2 Seeding growth of P. forrestii under calcium stress for 35 days

低濃度鈣會促進黑骨藤種子的生長,濃度過高反而會抑制種子的生長。從直觀形態上看,種子的真葉生長情況隨著鈣濃度的增大而呈梯度降低,說明鈣脅迫會抑制黑骨藤種子葉的生長,進而影響種子幼苗的光合作用。

2.4 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤幼苗生長指標的影響

實驗處理45 d后,在不同濃度鈣脅迫處理環境下的黑骨藤幼苗均能夠適應環境,但是各處理組之間的生長情況存在一定差異。在結束試驗后,對各處理組中黑骨藤幼苗的根長、根粗、須根數、葉長、葉寬、新葉片數、株高和側枝的數量進行測量與統計。由表3可知,30 mmol/L鈣脅迫處理組黑骨藤幼苗的根長與10,60 mmol/L兩個處理組間差異顯著。經不同濃度鈣脅迫環境處理下的黑骨藤幼苗根粗與對照組相比均差異極顯著,120 mmol/L高濃度鈣脅迫處理組的須根數相比于其他處理組具極顯著差異。各處理組的葉長與葉寬差異不顯著,新葉片數隨著CaCl2濃度的增大呈逐漸減小的趨勢,各處理組差異不顯著。不同濃度CaCl2脅迫對黑骨藤幼苗的株高有明顯的影響,如表3所示,隨著CaCl2濃度的增大,黑骨藤幼苗株高呈逐漸遞減的趨勢,各濃度鈣處理組與對照組相比差異極顯著。10,30,60,90 mmol/L鈣濃度處理下的黑骨藤幼苗株高趨于一致且無明顯差異,90,120 mmol/L處理組株高無差異。

表3 鈣脅迫處理45 d后黑骨藤幼苗的生長情況Table 3 Seeding growth of P. forrestii under calcium stress for 45 days

黑骨藤生長在獨特的喀斯特地貌地區,具有耐鈣的能力,但是黑骨藤生長在鈣濃度過高的環境下也會對其植株的生長造成一定的影響。側枝的生長也反映了植株的生長情況,從表3可看出,黑骨藤側枝數量隨著鈣濃度的升高而降低,對照組明顯高于處理組,說明在高鈣環境下對黑骨藤幼苗的生長具有抑制作用。

2.5 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤幼苗葉綠素含量的影響

由圖2可知,不同濃度鈣脅迫對黑骨藤幼苗中的葉綠素含量產生一定的影響,10 mmol/L鈣脅迫處理組黑骨藤幼苗葉片中的葉綠素含量累積最高,濃度達30 mmol/L后出現降低的趨勢,而后又升高,120 mmol/L處理組的葉綠素含量最低。與對照組相比,各處理組的葉綠素含量差異極顯著,說明葉綠素含量的高低與鈣脅迫的濃度密切相關,黑骨藤幼苗的光合作用在低濃度脅迫下有促進作用,但是隨著鈣脅迫濃度的增大,黑骨藤幼苗葉片中葉綠素的含量逐漸降低。高濃度鈣脅迫環境下黑骨藤植株光合作用低而導致該脅迫濃度下的幼苗出現萎黃的情況,這與隨著鈣脅迫濃度的增加,葉片數和側枝數逐漸減少的結果基本上一致,說明在高鈣環境下可以抑制黑骨藤的光合作用。

注:不同字母表示各處理組在0.05水平差異顯著。下同。圖2 鈣脅迫對黑骨藤幼苗葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of calcium stress on chlorophyll content of seeding of P. forrestii

2.6 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤幼苗谷丙轉氨酶活性的影響

由圖3可知,黑骨藤葉片中谷丙轉氨酶(GPT/ALT)的活性隨著鈣脅迫濃度的增大而升高,60～90 mmol/L處理組的變化不明顯,120 mmol/L處理組的酶活性最高,組間差異極顯著。在脅迫實驗中,轉氨酶會發生催化作用,谷丙轉氨酶的含量也會隨之升高,說明植物的組織受到了損害。

圖3 鈣脅迫對GPT/ALT活性的影響Fig.3 Effect of calcium stress on GPT/ALT activity

2.7 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤幼苗谷草轉氨酶活性的影響

由圖4可知,黑骨藤葉片中谷草轉氨酶(GOT/AST)的活性隨著鈣脅迫濃度的增大而呈升高的趨勢,其中,120 mmol/L處理組的酶活性最高,組間差異極顯著。當植物的組織受到損害時,轉氨酶會發生催化作用,谷草轉氨酶的含量也會隨之升高。

圖4 鈣脅迫對黑骨藤幼苗GOT/AST活性的影響Fig.4 Effect of calcium stress on GOT/AST activity of seeding of P. forrestii

2.8 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤幼苗POD活性的影響

由圖5可知,鈣脅迫對黑骨藤幼苗POD活性的影響,隨著鈣脅迫濃度的增加而呈逐漸升高的趨勢,10～60 mmol/L鈣脅迫處理組下黑骨藤幼苗葉片的POD活性趨于穩定,90 mmol/L后出現升高的趨勢,其中120 mmol/L處理組中黑骨藤幼苗葉片的POD活性最高。與對照組相比,各鈣脅迫處理組POD活性均具有極顯著差異。POD是反映植物組織老化的一項生理指標,其含量越高,說明植物組織衰老越嚴重,同時也說明其在生長的過程中產生了活性氧自由基。

圖5 鈣脅迫對黑骨藤幼苗POD活性的影響Fig.5 Effect of calcium stress on peroxidase activity of seeding of P. forrestii

2.9 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤幼苗可溶性糖含量的影響

由圖6可以看出,隨著鈣脅迫濃度的不斷增大,黑骨藤幼苗葉片的可溶性糖含量呈先升后降再升的趨勢,60 mmol/L處理組的可溶性糖含量為第一個峰點,90 mmol/L處理組可溶性糖含量出現降低,其中120 mmol/L處理組的可溶性糖含量最高。與對照組相比,各鈣脅迫處理組的可溶性糖含量差異極顯著,說明黑骨藤幼苗生長在鈣脅迫環境下受到了滲透脅迫。

圖6 鈣脅迫對黑骨藤幼苗可溶性糖含量的影響Fig.6 Effect of calcium stress on soluble sugar of seeding of P. forrestii

2.10 不同濃度CaCl2溶液對黑骨藤幼苗SOD活性的影響

由圖7可知,黑骨藤幼苗葉片SOD活性隨著鈣脅迫濃度的升高呈逐漸升高的趨勢,其中,120 mmol/L處理組的酶活性最高,組間差異極顯著。說明隨著鈣脅迫濃度的增加,黑骨藤幼苗體細胞受到了氧損傷。

圖7 鈣脅迫對黑骨藤幼苗SOD活性的影響Fig.7 Effect of calcium stress on superoxide dismutase activity of seeding of P. forrestii

3 討論與結論

3.1 討 論

3.1.1不同濃度鈣處理對黑骨藤種子萌發的影響

雖然鈣離子在一定程度上能維持和調控離子平衡以適應逆境環境的影響,但是當鈣離子濃度過高時會抑制植物的生長。有研究發現,鈣濃度過高會抑制種子的萌發,對種子的萌發產生抑制作用[11-13]。檀龍顏等[14]通過對金蕎麥種子的鈣脅迫研究發現,較高濃度的鈣離子會對種子產生離子毒害作用,抑制金蕎麥種子的萌發和生長。本研究表明,對照組黑骨藤種子的萌發情況最好,但隨著鈣濃度的增加黑骨藤種子萌發受到抑制。本實驗中未出現處理組種子不發芽的情況,從濃度的影響程度來看,10～30 mmol/L時鈣脅迫強度對黑骨藤種子萌發影響小,這與徐拾佳等[15]在鈣離子條件下對矮牽牛種子萌發影響的研究結果一致;而60～120 mmol/L時對其萌發影響較大。本研究表明,黑骨藤種子對鈣離子有一定程度的耐受性,但濃度過高對黑骨藤種子的影響就加大,抑制種子的萌發。

就生長指標來看,實驗結果表明,低濃度鈣脅迫對黑骨藤種子的生長受到的影響小,但當鈣濃度達到120 mmol/L時,種子僅露出胚根生長,且其他生長指標均為零,高鈣濃度條件下嚴重抑制了黑骨藤種子萌發后的生長。從真葉生長情況來看,隨著鈣濃度的增大,黑骨藤種子真葉生長情況(葉長、葉寬、真葉片數)逐漸受到抑制,表明鈣濃度過高會抑制黑骨藤種子萌發真葉的生長,進而影響其光合作用。綜上分析,說明黑骨藤種子對鈣離子有一定程度的耐受力,但是鈣濃度過高反而抑制其萌發。所以鈣濃度應控制在小于或等于30 mmol/L的范圍內,更有利于黑骨藤種子的萌發生長。

3.1.2不同濃度鈣處理對黑骨藤幼苗生長的影響

貴州是典型的喀斯特地貌,喀斯特地區的普遍特征是極度缺乏氮、磷、鉀的高鈣土壤環境[16],當植株生長在這樣的環境時,土壤的鹽分過多對植物造成一定的危害,同時對它的發育也會產生一定的影響[17]。鈣脅迫對植物的生長發育活動有一定的影響,隨著鈣脅迫強度的增加,其對植物正常的生長會產生一定的負面作用,比如說降低植株的生長高度等。彭博等[18]研究表明,在不同濃度鈣脅迫的影響下,狹葉香蒲的根系、株高、葉片等均受到不同程度的抑制。劉夢龍等[19]研究表明,在鈣脅迫環境下大白菜的根系、葉片等均受到不同程度的抑制作用。已有研究表明,在鈣脅迫環境下,可通過植株的株高及分枝變化反映其生長情況[20]。本研究中,鈣脅迫對黑骨藤幼苗的生長影響直觀表現是植株高度的變化、新葉片數量和側枝產生的情況,隨著鈣脅迫濃度的增大,黑骨藤幼苗的側枝數、新葉片數量以及株高均隨之減小。根系是脅迫環境最直接的受害部位,根據試驗結果得知,在不同濃度鈣脅迫環境下生長的黑骨藤幼苗根長和根粗均受到了不同程度的抑制,這與植物的根直接接觸到鹽溶液的原因有關,因為植物的根部最先能感受到鹽堿逆境的脅迫信號,是為了其能夠適應逆境所產生的生理反應[21]。隨著鈣含量的增加,當CaCl2濃度達到90 mmol/L和120 mmol/L時,黑骨藤幼苗出現枯死、萎黃的現象,說明在種植栽培黑骨藤時土壤含鈣量不宜過高,否則會因鈣濃度過高而影響到黑骨藤幼苗的生長與產量。

鈣脅迫對植物的生長會產生一定的負面作用,隨著鈣脅迫濃度的增加,對植株的直觀影響主要表現在其生長速度以及新葉片數逐漸下降,從而影響植株的光合作用[17]。柴勝豐等[22]采用不同濃度的CaCl2對金茶花生理指標影響進行實驗研究,結果表明,在不同濃度CaCl2脅迫環境下,兩種金茶花的生理指標主要表現在葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量的下降,說明在高鈣環境的影響下對其光合作用有影響。本研究表明,黑骨藤幼苗葉片的葉綠素含量隨鈣濃度的升高總體呈下降趨勢,尤其在120 mmol/L時含量最低,表明高濃度鈣脅迫會影響黑骨藤葉片的光合作用。可溶性糖是光合作用最終產物之一,同時也是植物在逆境下常見的滲透調節物質[23]。黑骨藤幼苗中可溶性糖含量隨鈣濃度的增加而呈逐漸升高的趨勢,說明黑骨藤幼苗在高鈣環境下受到了滲透脅迫。

SOD在活性氧代謝中具有重要作用,可以有效阻礙氧自由基對植物造成的毒害作用[24],廖汝玉等[25]研究表明,高鈣環境能夠引起枇杷小苗葉片中的過氧化氫含量、SOD和POD酶活性增加,表明在高鈣脅迫的環境下枇杷小苗產生了氧自由基,并且通過抗氧化酶系統來進行清除。本研究表明,黑骨藤幼苗POD、SOD活性隨鈣濃度的增大而逐漸升高,說明植物脂膜受到了氧化損傷,即產生了活性氧自由基,也進一步說明了黑骨藤幼苗在生長過程中主要依靠抗氧化酶系統來清除氧自由基;谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶是催化谷氨酸與丙酮酸、草酰乙酸之間的轉氨基作用的兩種酶,其轉氨作用可逆,在氨基酸代謝反應中具有重要作用[26],谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性隨鈣濃度的不斷增大呈逐漸升高趨勢,說明黑骨藤幼苗在生長過程中通過轉氨作用進行代謝反應。

綜上所述,在鈣脅迫環境下,黑骨藤幼苗對鈣離子表現出較強的耐受性,對其幼苗的生長發育及生理指標的變化情況進行分析,進一步證實了其對喀斯特地區富含鈣的土壤環境有一定的適應能力。根據調查得知,黑骨藤種子在萌發生長期是喜陰植物,野外分布的黑骨藤多以幼苗為主,分布稀疏,且幼苗難以成長發育為成年植株,反映了其對喀斯特地區土壤含鈣環境的適應較弱。

3.2 結 論

本研究探討了不同濃度鈣脅迫對黑骨藤種子萌發及幼苗生長的影響,為黑骨藤的引種繁育研究提供一定的數據參考。研究表明,黑骨藤種子萌發和幼苗在生長發育過程中,CaCl2濃度在低于30 mmol/L的條件下對黑骨藤種子萌發及幼苗生長的影響不顯著,黑骨藤種子及幼苗對弱鈣環境具有一定的適應性。因此,今后進行黑骨藤種植時,應提前對種植地的土壤含鹽量進行分析,選擇合適的土壤條件,從而避免在高鈣脅迫濃度下對黑骨藤種子萌發和幼苗生長的危害,影響黑骨藤種植產業的發展。