種子表型平臺的改進及其在芥菜種子活力研究中的應用

陸光遠, 游永全, 劉羽婷, 李春生, 韋明肯, 歐陽樂軍, Steven Penfield, 趙永國

(1.廣東石油化工學院生物與食品工程學院, 廣東 茂名 525000; 2.湖北工程學院, 湖北 孝感 432000;3.Department of Crop Genetics,John Innes Centre,Norwich NR4 7UH,UK)

葉用芥菜是我國重要的大宗蔬菜,主要包括大葉芥菜、花葉芥菜、瘤柄芥菜、包心芥菜和分蘗芥菜等多種類型[1],在華南地區常見的芥菜類型包括大葉芥、多裂葉芥、皺葉芥菜、包心芥和水東芥等,其中水東芥菜是以產地賦名的嶺南特色名優蔬菜,屬于十字花科蕓薹屬的葉用芥菜(BrassicajunceaL. Coss. var. folosa Bailey,2 n=4 x=36)。水東芥菜歷史悠久,主要分布在粵西地區,具有小卷心、莖多葉少、爽脆可口、質嫩無渣、鮮甜味美等特點,深受國內和港澳地區市場歡迎,2007年獲得中國國家地理標志產品保護[2]。隨著華南地區工業化的完成,農村勞動力成本大幅提高,當前大田蔬菜生產方式正由傳統的勞動密集型向規模化、機械化生產發展,通過機械精量播種,可實現一播成苗,避免育苗移栽,從而省工省時,大幅度降低蔬菜生產成本。高活力種子能夠顯著提高田間出苗率、抵御不良環境條件、增強抗性,是實現精量播種、一播全苗的前提。目前關于芥菜種子活力的研究報道較少。

土壤鹽堿化是制約現代農業可持續發展的主要因素之一。我國鹽堿地近1億hm2,廣泛分布在內陸和沿海地帶,其中華南沿海的鹽害類型以氯化鈉為主[3]。葉用芥菜作為嶺南地區的重要蔬菜,播種和出苗期受到鹽堿地的影響嚴重。因此,開展芥菜耐鹽堿性研究,提高種子活力,特別是大田直播條件下芥菜種子萌發和出苗期的耐鹽堿性,對于保障我國蔬菜供給安全具有重要意義。

種子萌發是植物生長的第一步,需要在充足的水分、空氣和適宜的溫度下進行,其過程可分為吸脹、萌動、發芽和成苗四個階段;種子必須從外界環境吸收足夠的水分才能啟動一系列酶的活動,開始萌發;當環境水勢低于某個臨界值時,種子因無法吸收足夠水分而停止萌發[4]。近十年來,種子萌發期耐鹽性的鑒定已有較多報道,裴毅等[5]分析了白芥種子在不同鹽濃度和NaHCO3脅迫下的耐受性;龍衛華等[6]比較了3種油菜萌發期間的耐鹽性差異;蹇黎等[7]研究了Na2CO3脅迫對野生油菜種子萌發的影響。在芥菜中,崔世友,張蛟蛟[8]通過灘涂種植和根際土壤電導率測定,鑒定出了強耐鹽的野生葉用芥菜材料。王潔等[9]對5個芥菜品種的耐鹽性進行綜合評價,認為發芽期耐鹽性大小依次為甬雪4號、甬雪3號、甬雪1號、科興雪菜、大豐雪菜。

通過數學建模可以深入研究種子的萌發特性。盡管采用經驗的數學模型(比如Hill函數)也可以擬合種子萌發過程,但由于模型中沒有引入溫度、水分等環境變量,因此無法分析和預測外界因素對種子萌發的影響,也不利于開展遺傳機理研究[4]。另外,基于群體閾值的數學模型,比如積水(Hydrotime,HT)、積溫(Thermal time,TT)和積溫水(Hydrothermol time,HTT)模型,由于這些模型中引入了環境溫度T、水勢Ψ等變量,因而可以定量分析種子萌發對溫度、水分脅迫的響應[10-12]。最近,有研究人員進一步提出了積鹽(Halothermal time, HaloTT)模型,用以動態描述鹽脅迫下種子萌發速度與鹽濃度之間的函數關系[13-14],即:

θHalo=(NaClb(g)-NaCl)tg

(1)

式中,θHalo為常數,NaCl為氯化鈉介質濃度,NaClb(g)為種子萌發百分率為g時所能夠忍受的最高NaCl濃度,tg為種子萌發百分率達到g所需要的時間。利用上述函數,可以精確預測芥菜種子在鹽脅迫下的萌發動力學特性,為研究芥菜高活力種子的遺傳機理奠定基礎。

本研究在參照前人工作的基礎上,改進并構建了新一代的低成本、高通量種子表型平臺,可實現無人值守運行,同時利用該平臺對芥菜發芽期耐鹽性進行了定性和定量分析,旨在為芥菜耐鹽品種的選育和栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料為芥菜種子,購自陽春農業生產資料公司,可在華南沿海地區種植。

1.2 種子表型平臺構建

參照Colmer等[15]的方法,改進并構建了一個種子表型平臺SeedGerm V 2.0(圖1 a),主要硬件包括:1個透明的塑料盒(長47 cm×寬34 cm×高29 cm),1個USB接口微型霧化器,1臺卡片式微型電腦(樹莓派)及其配套的攝像頭,按當前市場價其成本不足1 000元,一次可分析小粒種子(芥菜、油菜、辣椒等)300粒或大粒種子(玉米、大豆等)100粒。后期的圖像存儲和數據分析可在普通的辦公電腦進行。發芽箱底部放置一張藍色的發芽濾紙(可用藍色吸水棉布代替),藍色與種皮顏色反差較大,有利于后期的圖像數據處理分析。噴霧裝置用定時開關控制,以便維持發芽箱的恒定濕度,省去了種子發芽過程中的人工補水程序,可實現全過程無人值守,提高工作效率(圖1 b)。

注:a為種子平臺總體結構;b為發芽盒俯視圖。圖1 新一代種子表型平臺SeedGerm V 2.0Fig.1 New generation of seed phenotyping platform SeedGerm V 2.0

1.3 種子發芽實驗

分別配制5個梯度的NaCl溶液(0,0.075,0.150,0.225 mol/L和0.300 mol/L),模擬不同鹽脅迫環境。發芽紙平鋪在托盤上,加入相應的NaCl溶液30 mL浸泡20 min,使其充分濕潤。挑選健康、飽滿、無損傷的芥菜種子,先用3%次氯酸鈉消毒10 min,然后蒸餾水反復沖洗干凈,之后用鑷子將種子均勻地擺放在發芽紙上,每個處理50粒,3次重復。托盤放入種子表型平臺,啟動程序,開展萌發實驗。每天檢查發芽情況,并利用微型噴霧器定時補水保濕,發芽試驗總天數設置為8 d,人工判讀的發芽標準為種子胚根突破種皮1.5 mm。

1.4 發芽圖像采集與處理

在種子發芽過程中,首先利用樹莓派控制的攝像頭自動定期(比如1張/h)抓拍圖片,實驗結束后將所有圖片通過網絡輸入計算機。當圖像采集程序開始運行后,盡量不再移動發芽箱的位置,否則可能影響拍攝質量,不利于后期對結果進行分析。人工刪除曝光不足(晚上拍攝)的圖片,同時對圖像進行適當的裁剪和對比度調整,最后將系列圖像導入軟件SeedGerm(https://github.com/Crop-Phenomics-Group/SeedGerm/releases)中運行,可自動獲得發芽率、平均發芽時間等數據。

1.5 種子萌發參數估算

將種子表型平臺輸出的種子發芽數據導入MS Excel 2019軟件,利用Hill函數進一步進行曲線擬合,計算獲得T50(發芽率達到最大值一半所需的時間)、U2575(發芽率達到75%與25%所需時間之差)、AUC(發芽曲線面積)、MGT(平均萌發時間)等種子萌發動力學參數,可以比較種子在不同鹽脅迫環境下的種子活力、整齊度、一致性的變化情況,從而評價種子萌發期的耐鹽性。

1.6 積鹽模型的構建與預測

由于Hill函數沒有引入鹽濃度等關鍵參數,因而無法對不同鹽脅迫下的種子萌發情況進行分析和預測。為此,進一步利用HaloTT模型分析發芽數據。通過公式(1)變換后得到公式(2),其生物學含義更加直觀,即種子萌發速度GR與鹽濃度NaCl呈線性關系,其斜率的倒數即為θHalo:

GR=1/tg=[NaClb(g)- NaCl]/θHalo

(2)

其中:θHalo為積鹽常數;NaCl為種子開始萌發的NaCl介質濃度;NaClb(g)為基礎鹽濃度,即種子萌發時能夠忍受的最高NaCl濃度,該值與發芽百分比g有關,近似服從正態分布;tg為達到種子萌發百分率g所需要的時間;1/tg為萌發速率GR。利用Origin 2018軟件進行線性回歸分析,可估算參數θHalo和NaClb(g)。由于種子萌發曲線近似于正態分布,因此通過probit轉換可將曲線轉化為直線,以便估算參數:

Probit(g)=[NaCl+θHalo/tg-NaClb(50)]/δNaClb

(3)

在上述公式中,NaClb(g)服從正態分布,其平均值為NaClb(50)(即種子萌發率為50%時所能忍受的最高NaCl濃度),標準方差為δNaClb[14]。

2 結果與分析

2.1 種子發芽動態檢測

利用改進后的種子表型平臺SeedGerm V 2.0,在5種不同NaCl濃度脅迫下分別進行芥菜種子萌發實驗(圖2 a)。每次發芽實驗設置3個重復(50粒/重復),種子放置在發芽紙(布)上,成像間隔為1 h,共采集了192張圖像,歷時8 d。可以看出,種子發芽120 h后,在低濃度的NaCl中,幾乎所有種子都能夠發芽,而且胚芽較長;而在中等和高濃度鹽脅迫下,發芽率明顯下降,甚至不能萌發(圖2 a)。種子平臺軟件通過對大量圖片的處理和分析(圖2 b),可直接輸出累積萌發曲線,T30、T50、T70發芽時間(可用來評價萌發的整齊度),以及Gmax(試驗結束時種子的最終發芽率)(圖2 c)。此外,軟件還自動生成了須盒圖(示例中展示了T50的統計離散性),以方便評估發芽的均勻性或變異性。最后,軟件還提供了不同時間點所有種子萌發數據的Excel文件,以便對所有數據進行整合后進一步統計分析。

2.2 種子表型平臺的可靠性

為了驗證種子表型平臺及圖像分析軟件Seed Germ的可靠性,對芥菜種子在正常條件下的發芽圖像進行軟件識別和人工統計,并比較兩者的異同。結果表明,SeedGerm軟件生產的種子萌發數據與人工統計結果整體上的發芽率增長趨勢基本一致,但是軟件生產的種子萌發數據折線圖整體略為滯后于人工統計的種子萌發結果(圖3),這可能是由于判定種子萌發的標準差異造成的。軟件將種子的體積增長超過10%判定為發芽,而人工的判斷標準是胚根長度達到1.5 mm或種子直徑的一半。進一步計算了軟件生成和人工判讀發芽數據的相關性,結果發現其相關系數為 0.988,達到極顯著水平(p<0.001),表明種子平臺具有較高的可靠性和準確性,適合開展芥菜種子活力研究。

圖3 SeedGerm生產和人工統計的芥菜種子發芽率比較Fig.3 Comparison of mustard seed germination rate obtained by SeedGerm and artificial counting

2.3 芥菜種子對鹽脅迫的響應

由圖4可知,對照的發芽情況較好,發芽44 h后發芽率即達到100%。在極低鹽濃度(0.075 mol/L)條件下,種子的萌發不但沒有受到抑制,反而具有一定的促進作用,實驗開始12 h后發芽率為28%,高于對照的20%,表明適量的NaCl是維持植物生長發育所必需的,其最終發芽率與對照相近。隨著鹽濃度的升高,種子發芽開始受到明顯影響,在0.150 mol/L條件下,種子的最終發芽率降低到80%,同時達到最終發芽率所需時間延長到60 h左右;在中度(0.225 mol/L)鹽脅迫下,種子的發芽率僅有40%,達到最終發芽率的時間繼續推遲到80 h左右;而在重度(0.300 mol/L)鹽脅迫下種子基本喪失了發芽能力,同時達到最終發芽率所需時間>100 h(圖4)。由此可見,極低濃度的鹽能夠促進發芽,但隨著濃度的升高,種子的發芽受到抑制,且可以明顯看出種子萌發率、萌發速度均與NaCl濃度成反比。

注:發芽率為均值±標準差(n=3)。圖4 不同NaCl濃度下芥菜種子萌發曲線Fig.4 Germination curve of mustard seeds under different NaCl concentrations

2.4 芥菜種子的萌發動力學分析

利用Hill函數對芥菜種子在不同鹽濃度下的種子萌發曲線進行擬合,并求算出最終發芽率、T50、Gmax(h)、U7525(h)、AUC、MGT等特征參數(表1),以便比較不同基因型芥菜的耐鹽性差異。

表1 不同NaCl脅迫下的種子萌發參數Table 1 Germination parameters of mustard seeds under different NaCl stresses

T50為達到最高萌發率一半所需的時間,時間越短,表明種子活力越高。在NaCl濃度為0 mol/L的條件下芥菜種子的T50值較小(14.2 h),表明供試品種的種子活力很強,14 h左右即有一半種子萌發;隨著鹽濃度的升高,總體上T50值也逐漸變大,但在0.075的極低濃度條件下,T50值不升反降,僅為12.5 h,再次說明極低濃度的鹽溶液能夠促進種子萌發,加快發芽速度。當鹽濃度為0.15～0.225 mol/L時,T50顯著增大到30 h左右,而在NaCl濃度為0.300 mol/L的條件下芥菜種子的T50值最大,為56.8 h,表明種子發芽嚴重受阻。

U7525是指達到發芽率75%與25%所需時間的差值,該值越小,表明種子的萌發一致性和整齊度越好。可以看出,在水或低鹽濃度下,芥菜種子的U7525在3.0～10.6 h之間,數據較小,說明發芽的一致性較高,而NaCl濃度為0.225 mol/L時,U7525急劇上升到23.8 h,說明高濃度鹽溶液延緩了發芽,并且發芽整齊度較差;當鹽濃度上升為0.300 mol/L時,U7525值又降低至5.6 h,這是由于高鹽脅迫下種子總體的發芽率較低、變異較小造成的。

AUC是指種子萌發曲線下的面積,能更加全面、綜合地反映種子萌發的質量,AUC值越大,表示種子萌發的速度越快、質量越好。在對照和極低鹽濃度條件下,芥菜種子的AUC值在179%/h以上,表明種子活力最強,在中等鹽濃度條件下(0.15 mol/L),AUC值降低到135.5%/h;在高鹽條件下(0.225～0.300 mol/L)AUC值僅有67%/h以下,表明其種子活力較差。由此可見,AUC值十分靈敏,適合于作為逆境脅迫下種子活力鑒定的重要指標。

MGT是指所有種子完成萌發所需時間的平均值,MGT值越小,說明種子萌發的速度越快,種子活力越高。MGT的變化趨勢與T50相似,即鹽濃度越高,種子平均萌發時間就越長,該種環境條件下種子的活力就越低(表1)。

2.5 鹽脅迫下種子萌發的積鹽模型及預測

芥菜種子的萌發曲線為“S”型曲線,近似服從正態分布的累積函數,通過Probit轉換可以轉化為直線,方便模型擬合和參數估算。在本研究中,利用公式(3)對不同鹽濃度下的芥菜種子的種子萌發數據進行了擬合,構建了以鹽濃度(X)為自變量、種子發芽率(Y, probit轉換)為因變量的預測模型(公式):

Y=-14.993X+3.289

(4)

上述預測模型的決定系數R2為0.923,達極顯著水平(p=0.008),說明曲線擬合效果良好(圖5)。擬合后得到積鹽常數θhalo為2.26 mol/(L·h);根據上述線性方程的斜率和截距,可以進一步求得NaClb(50)為0.22 mol/L,其標準方差δNaClb為0.067 mol/L。利用這些參數,得到鹽脅迫下發芽率的預測方程為:

圖5 Halothermal time模型回歸分析芥菜種子的萌發Fig.5 Regression analysis of Halothermal time model for mustard seed germination

Probit(g)=(NaCl+2.26/tg-0.22)/0.067

(5)

利用公式(5)可以預測在一定范圍內不同鹽濃度下芥菜種子的種子發芽率。比如,利用預測模型計算芥菜種子在上述5個NaCl濃度梯度下的預測發芽率,結果發現,預測結果與實驗數據較為吻合,決定系數R2在0.867～0.963之間,說明預測效果良好。

3 討論與結論

種子不僅是重要的食物來源,也是最重要的農業生產資料。種子質量對作物產量具有決定性作用[16],因此開展種子活力研究十分必要。長期以來,種子發芽實驗基本靠人工進行,不僅工作量大,勞動強度高,而且效率低、周期長,還容易受到實驗人員主觀因素的影響,因而限制了種子科學研究的規模和準確性[17]。 近十年來,隨著植物表型組學的快速發展,一些適用于種子萌發和幼苗活力研究的表型平臺已經涌現,比如Germinator、MultiSense、PhenoSeeder、SeedAIXPERT 和 SAGA等[18-22],這些技術平臺雖然技術先進,但由于成本高昂、技術復雜、通量低,普通實驗室難以獲得,因而其應用僅僅局限在少數的國家研究中心或跨國種業公司手中。為此,Colmer等[15]開發了低成本、高通量、易拓展的SeedGerm種子表型平臺,十分適合普通實驗室和種子公司使用。但該平臺在使用過程中,需要頻繁打開帶有攝像頭的發芽箱蓋子進行人工補充水分,操作十分繁瑣,很容易使攝像頭位置變動,造成拍攝的圖像位移,給后續的圖像處理帶來困難。為此,在發芽盒內部添加了微型噴霧裝置(圖1),可定期自動加水,無須人工干預,從而實現了無人值守運行,工作效率進一步提高,效果良好。利用該平臺分析了芥菜種子在不同鹽脅迫下的種子發芽情況,發現機器判讀的發芽數據與人工統計結果十分接近,相關性達到極顯著水平,充分說明該發芽平臺的可靠性(圖2)。盡管如此,該平臺仍然存在一些不足,比如樹莓派的攝像頭較小,分辨率和景深有限,如果種子過小(擬南芥種子),則難以獲得足夠清晰的圖像;在補水過程中,噴霧器噴灑出來的水分同樣會使樹莓派的鏡頭模糊不清,影響拍攝圖像質量。

種子在大田條件下很容易受到溫度、水分、鹽堿等環境因素的影響[23],而且隨著全球氣候變暖,未來干旱、炎熱和鹽堿化將進一步加劇,因此需要有一個種子萌發預測模型,以便在生產前進行規劃和決策[24]。油菜種子發芽率會隨著鹽度的增加而下降,濃度達到250 mmol/L時完全停止發芽[25],這種發芽率降低通常與較低的滲透勢和離子毒性有關[26]。以往研究表明,鹽脅迫通過改變酶活性、破壞細胞膜和細胞器,破壞參與發芽的生物分子的結構和功能來影響種子活力[27]。種子吸收鹽離子的能力取決于細胞膜的通透性,通過調節其內部滲透勢,可以增加胚胎膨壓,使種子可在較低的水勢下萌發[14]。

HaloTT模型可以表征一個種子群體在萌發過程中的平均表現(即NaClb(50))以及個體之間的變異(即σNaClb);NaClb(50)下降的原因可能是細胞膜完整性喪失,其證據之一是種子浸出液的電導率值增加[23]。而且具有更大NaClb(50)和σNaClb的種子群體可以在更多和更復雜的逆境脅迫環境下萌發[28]。因此,種子群體閾值NaClb(50)可作為有效預測發芽時間或決定種子活力的指標[29]。通過記錄種子在一系列環境條件下的發芽時間,并計算種子萌發模型閾值等參數,可以預測該種子群體的發芽率和時間[30]。Liu等[23]以13個一年生沙漠物種為研究材料,在實驗室采集發芽數據,構建HaloTT模型,可準確描述和預測該物種在相同棲息地的發芽時機和發芽率。本研究初步構建了HaloTT模型,可以準確預測芥菜種子在實驗模擬鹽脅迫條件下的種子發芽率(圖6),但能否預測大田的發芽情況還需要開展更多的野外實驗。

注:線為模型預測值,點為實驗測定值。圖6 利用Halothermal time模型預測芥菜種子在不同NaCl濃度脅迫下的萌發情況Fig.6 Prediction of germination under different NaCl concentration for mustard seeds using Halothermal time model

綜上,本研究利用種子表型平臺,能夠準確記載種子萌發的動態過程并自動生成發芽數據,在此基礎上進一步利用基于群體閾值的數學模型,對鹽脅迫下芥菜種子的萌發動力學進行定量分析,構建了一個可準確預測一定范圍內不同鹽脅迫條件下的芥菜種子發芽率,從而為芥菜大田生產提供決策依據。