TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物高效液相色譜固定相研究*

李斗發，李亞楠，劉華林，字 敏

(云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500)

引言

在臨床上使用的很多藥品是手性藥物[1]。不同的異構體具有不同的生理活性、物理和化學性質，有些藥品一個對映體有藥效，另一個對映體可能沒有藥效，甚至對人的身體健康有害[2]。所以，對具有手性的藥物進行分離具有重大的現實意義。由于外消旋體的理化性質差別很小，很難把對映異構體分離開[3]，分離手性藥物的方法很多，其中比較典型的有毛細管電色譜(SEC)、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)等[4-6]。手性固定相CSP(Chiral stationary phase，CSP)分離手性化合物是當前比較熱門的研究方向，使用比較廣的是多糖、環糊精和冠醚作為固定相[7-9]。

在過去的十多年里，研究員對共價有機骨架材料COFs(covalent organic frameworks，COFs)做了很多探索和研究，因為其具有很多優良的性能，例如，具有高的表面積、孔的體積、形狀容易調節，方便組裝[10]。COFs大量應用于氣相色譜、液相色譜[11]、催化和識別等[12]領域。

本文使用后合成修飾法[13]和溶劑熱合成法[14]，獲得了具有手性的TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物，將其采用網包法[15-16]覆蓋在球形硅膠上，用于制備手性固定相。實驗結果表明TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物能夠很好地分離手性藥物、氨基酸以及位置異構體。與此同時，制備的手性固定相填充的分離柱具有較好的穩定性。通過研究表明，制備的手性CSP在分離手性化合物具有較大的潛能。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

D-Max-3B 2000X粉末衍射儀(日本，Rigaku公司)；S-3000N掃描電子顯微鏡(日本，Hitachi公司)；Chirascan圓二色光譜儀(英國，應用光學物理)；BRUKERTensor-27傅里葉紅外變換紅外光譜儀(德國，Bruker)；ASAP2020 氮氣吸附儀(美國，Micromeritics公司)；EliteP230Ⅱ高壓流壓泵(大連依力特分析儀器有限公司)；EliteUV230Ⅱ 紫外檢測儀(大連依力特分析儀器有限公司)；AT-330柱溫箱(大連依力特分析儀器有限公司)；1666液相色譜裝柱機(美國，Alltechi有限公司)；200 mm×φ4.6 mm 不銹鋼高效液相色譜空柱(美國，Alltechi有限公司)；UniSil 5-100硅膠(蘇州納微科技股份公司)。

六亞甲基四胺(97%)、三氟乙酸(97%)、鄰硝基苯胺(99%)、碘化鉀(98%)、高碘酸鉀(99%)、位置異構體(99%)均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺(≥99%)、二茂鐵二氯化鈀(99%)、均三甲苯(99%)、無水SnCl2(99%)均購于上海阿達瑪斯試劑公司；氯化鈉(≥99%)、葡萄糖(99%)購于天津市風船化學試劑科技有限公司；1，4二氧六環(98%)，外消旋化合物(99%)均購于美國Sigma-Aldrich有限公司；間苯三酚(98%)購于鄭州阿爾法化工有限公司。

1.2 單體1，3，5-三甲醛間苯三酚(Tp)的合成

取用經干燥后的 7.549 g 六亞甲基四胺(54 mmol)，3.007 g 間苯三酚(24.5 mmol)，加入 500 mL 的三頸燒瓶中。對裝置抽真空后充滿N2，在N2的保護下，邊攪拌邊加入 90 mL 三氟乙酸，后將裝置移入油浴鍋，在 100 ℃ 下攪拌 3 h 后，取用配制好的 0.3 mol/L 的鹽酸溶液 150 mL 加入到反應容器中，再反應 2.5 h。燒瓶取出冷卻后，用二氯甲烷萃取產物，取有機相層，蒸發掉溶液后，用甲醇抽濾洗滌產物，得到單體1，3，5-三甲醛間苯三酚(Tp)，產物呈粉色。

1.3 單體3，3′-二硝基聯苯胺(DNB)的合成

取 1.24 g 4-碘-2-硝基苯胺(5 mmol)，三乙胺 1.4 mL，0.016 g 二茂鐵二氯化鈀(DPPF，0.5 mmol)，17.5 mL 無水甲苯，依次加入到 100 mL 二頸燒瓶中，在90～130 ℃ 下攪拌反應 12 h，得到單體3，3′-二硝基聯苯胺(DNB)，產物呈紅色、粉末狀。

1.4 TpBD(NH2)2的合成

稱取 21.0 mg 的Tp(0.1 mmol)，41.1 mg 的DNB(0.15 mmol)，均三苯甲醛 0.75 mL，1，4-二氧六環 0.75 mL，3 mol/L 醋酸 0.5 mL，于Pyrex耐熱玻璃管中，超聲至其混合均勻。用液氮冷凍后，抽真空脫氣，用酒精噴燈封管，在 120 ℃ 的條件下反應 72 h，待反應完成后，將玻璃管敲碎，取出產物，依次用丙酮、二氯甲烷洗滌，得到呈紅棕色的產物。

取 3 g SnCl2·2H2O和 150 mg 上述合成的TpBD(NO2)2于 50 mL 的二頸燒瓶中，加入 5 mL 無水四氫呋喃使其混合溶解，在 50 ℃ 條件下加熱回流 3 h。反應完成后，將沉淀物用 70 mL 的 1 mol/L 鹽酸洗滌10次，用 70 mL 的水洗滌3次，并用 100 mL 丙酮洗滌一次。然后取上步產物于合適的反應釜中，加入 5 mL 苯甲醚，在 120 ℃ 烘箱內加熱 24 h。最后，將粉末過濾并用 100 mL 丙酮洗滌。得到紅棕色產物 TpBD(NH2)2，合成路線如圖1。

圖1 TpBD(NH2)2的合成路線

1.5 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的合成

稱取 150 mg 上述合成的TpBD(NH2)2，1 g 干燥后的D-葡萄糖，20 mL 無水甲醇于 50 mL 的二頸燒瓶中，在 70 ℃ 條件下攪拌 4 d，待反應完成后，用純水洗去未反應完的葡萄糖，烘干，得到紅棕色的產物。合成路線如圖2。

圖2 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的合成路線

1.6 利用網包法制備TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相

將TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物用瑪瑙研缽研磨至比硅膠還細，稱取 1.0 g 哌嗪于 50 mL 容量瓶內，加入異丙醇和 2 mL 三乙胺配制成 50 mL 溶液，稱取 100 mg 研磨好的TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物加入到一定量配制好的上述溶液中，超聲后浸泡上述硅膠3～ 4 h，吸出多余液體，在 110 ℃ 烘箱里加熱處理 15 min，備用。

1.7 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相色譜柱的填充

稱取 4.2 g 制備好的固定相，用有機膜濾過的正己烷/異丙醇(體積比9∶1)為溶劑，用250目的篩子，將固定相用溶劑濕法過篩，待固定相沉降后，倒出上清液。采用高壓勻漿法裝柱，在裝柱機的溶劑罐中加入約 800 mL 的上述溶劑，向過篩后的固定相加入約 40 m L的上述溶劑，倒入勻漿罐前，為保證固定相分散均勻，要攪拌后立即倒入。擰緊裝置后，保持 35 MPa 5 min，后將壓力調為 25 MPa 保持 30 min，結束后打開減壓閥，取下色譜柱，裝上柱頭，貼上標簽標識上下端，裝到液相色譜儀器上，用正己烷/異丙醇(體積比9∶1)為流動相，0.5 mL/min 的流速沖洗色譜柱，待基線穩定即可測樣。

1.8 色譜拆分條件和性能評價參數

用正己烷/異丙醇(體積比9∶1；8∶2)和甲醇/水(體積比9∶1；8∶2)作為流動相，流速為 0.5 mL/min，紫外檢測波長分別為 254、210，220 nm，柱溫為 25 ℃。

對色譜柱的分離效果用保留因子k，分離因子α和分離度Rs進行評價。公式分別為：

k1=(t1-t0)/t0

(1)

k2=(t2-t0)/t0

(2)

(3)

(4)

2 結果與討論

2.1 1，3，5-三甲醛間苯三酚(Tp)和3，3′-二硝基聯苯胺(DNB)的表征

對1，3，5-三甲醛間苯三酚(Tp)進行核磁共振氫譜表征。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：10.18(s，3H，CHO)，14.15(s，3H，OH)。對DNB進行核磁共振表征。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：7.1(d，J=8.9Hz，2H)，7.54(s，4H)，7.74(dd，J=2.3Hz，2H)，8.14(d，2H)。上述所得數據與文獻報道[16]一致，表明已經成功合成Tp和DNB。

2.2 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性硅膠球的表征

2.2.1 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的粉末X衍射表征分析

據文獻報道，TpBD(NO2)2的PXRD圖案在對應于(100)面的3.5°處顯示出強烈衍射，6.0°、9.4°和26°的反射分別歸因于(110)、(210)和(001)平面，屬于AA堆疊模式。由圖3看出，在3.5°、6.0°、9.4°、26°均出現了衍射峰，與文獻報道一致[1-3]，表明TpBD(NO2)2成功合成。經還原的TpBD(NO2)2和用D-葡萄糖修飾后的TpBD(NH2)2，其主要衍射峰也在3.5°、6.0°、9.4°、26°處，三者的峰形和出峰的位置基本相似，這也說明還原以及修飾后的物質的晶型和結構特征基本保持不變。

a.TpBD(NO2)2，b.TpBD(NH2)2，c.TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物

2.2.2 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的紅外表征

TpBD(NO2)2、TpBD(NH2)2和TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的紅外表征如圖4所示，從圖4(a)TpBD(NO2)2的紅外圖可以看出，TpBD(NO2)2在 1512 cm-1和 1362 cm-1有吸收峰，對應于-NO2的特征吸收峰。從圖4(b)TpBD(NH2)2的紅外圖顯示，對比圖4(a)，在 1512 cm-1和 1362 cm-1處的峰強度減弱，說明TpBD(NO2)2中的-NO2被還原了。觀察圖4(c)在 1069 cm-1左右為C-O的特征吸收峰，對比圖4(b)，強度有所增強，說明D-葡萄糖成功修飾了TpBD(NH2)2。

a.TpBD(NO2)2，b.TpBD(NH2)2，c.TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物

2.2.3 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物氮氣吸附測試

為了進一步了解合成的D-葡萄糖衍生物的結構特征，我們對其進行了氮氣吸附測試，結果見圖5。使用Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法對測量數據進行計算，得到TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的比表面積為 264 m2·g-1，孔體積為 1.78 cm3·g-1，通過Barrett-Joyner-Halenda(BHJ)分析計算測試數據，得到其平均孔徑是 1.92 nm(圖5b)，符合相關文獻報道的參數。

圖5 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的氮氣吸附測試

2.2.4 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的圓二色譜分析

如圖6所示通過D-葡萄糖修飾后的 TpBD(NH2)2顯示出了Cotton效應，表明葡萄糖成功修飾在COF上，使衍生后的TpBD(NH2)2具有手性。

圖6 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物圓二色譜圖

2.2.5 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的掃描電鏡

為了觀察采用網包法后，TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物有沒有固載到硅膠上，分別通過掃描電鏡對空硅膠和網包后的固定相進行觀察，結果見圖7。通過電鏡圖片可以觀察到，沒有經過網包的硅膠表面光滑，沒有任何物質固載在其表面，而經過網包的硅膠，其表面固載了大量的經過研磨的TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物，說明通過網包法，所合成的手性COF材料已成功固載在硅膠表面。

(a)純硅膠，(b)TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物固定相

2.3 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相對于外消旋體的拆分

為了檢測TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物制備的色譜柱的拆分能力，用其對外消旋體進行拆分。實驗結果顯示，所制備的手性色譜柱對15種手性物質能夠進行不同程度的分離。其中CH3OH/H2O(體積比9∶1)的流動相對4種手性物質有一定的拆分效果，分別為二苯基乙醇酮、華法林、N-(3，5-二硝基苯甲酰)-L-亮氨酸、1-苯乙醇，而CH3(CH2)4CH3/(CH3)2CHOH的流動相對11種手性物質有一定的拆分效果，它們分別是2-甲基戊酸甲酯、2-乙基己酸、1，2-環氧丁烷、環氧溴丙烷、3-氯-2-丁酮、2-甲基戊醛、3-羥基丁酸乙酯、異丙基縮水甘油醚、乳酸乙酯、1-(1-萘基)乙胺、γ-辛內酯。它們的拆分結果見表1。

表1 色譜柱對15種手性物質的拆分結果

表1的分離結果顯示，在CH3OH/H2O(體積比9∶1)的流動相條件下，所拆分的外消旋體中，二苯基乙醇酮和華法林做到了基線分離，拆分情況比較理想。在CH3(CH2)4CH3/(CH3)2CHOH的流動相條件下，2-乙基己酸、環氧溴丙烷、乳酸乙酯等達到了基線分離。兩種流動相條件下，所拆分的物質不相同，能夠相互補充，拓展了TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相的拆分范圍，該手性色譜柱所拆分的部分手性物質的譜圖如圖8所示。

圖8 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色譜柱對外消旋體的部分圖譜

測試結果顯示TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物對一些手性物質具有比較好的分離效果，有些甚至能達到基線分離。能夠對手性物質進行拆分的原因是，COFs材料上被修飾了D-葡萄糖手性基團，使COFs材料具備了手性，手性COFs材料對兩種對映異構體存在保留差異，從而能夠對手性化合物進行拆分。除此之外，手性固定相和手性物質之間的各種作用力，可能也在某種程度上對這些物質的分離作出貢獻。

2.4 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物液相色譜柱對于苯系位置異構體的拆分

為了探究TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物對于苯系位置異構體的分離情況，我們用所制備的色譜柱對苯系位置異構體進行了實驗。在所分離開的這些物質中，該色譜柱對o，m，p-鄰溴苯胺、o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-氯苯酚能夠進行一定程度的分離。它們的拆分結果見表2，拆分譜圖見圖9。

表2 色譜柱對2種位置異構體的拆分結果

圖9 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物液相色譜柱對苯系位置異構體的部分色譜拆分圖

從圖9中可以觀察到，因苯系位置異構體的分子結構存在一些差異，因此導致它們在經過色譜柱時，該固定相對它們的作用不同，使得它們隨著流動相從色譜柱中流出的時間不相同，即彼此的保留時間有差別，這也正是它們能夠被拆分的原因。從分離圖譜可知，TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色譜柱對3種苯系位置異構體都有一定的拆分效果，這也拓展了TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相在物質分離方面的應用。

2.5 溫度對TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色譜柱的影響

為了研究不同溫度對TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色譜柱出峰情況的影響，選用華法林進行測試。探究了25、30、35、40、45 ℃ 五個檢測溫度對TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相出峰效果的影響。從對比譜圖(圖10)中可見，隨著溫度的升高，其保留時間在逐漸往后移動。因此可知，在一定溫度范圍內，隨著溫度的升高，對色譜柱的出峰情況沒有太大影響，只有保留時間在后移，不影響出峰情況。

圖10 不同溫度下華法林在TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物在色譜柱上的分離譜圖.

2.6 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色譜柱的重復性

為了探討TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物所制備的色譜柱的重復性，選擇華法林為代表，重復測樣5次，其拆分譜圖如圖11所示，經過計算，第一個峰的峰面積與保留時間的相對標準偏差(RSD)分別為1.34%和1.25%。這一結果表明，TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物所制備的色譜柱具有良好的重復性。

圖11 華法林在TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色譜柱上的重復性分離譜圖

3 結論

本文通過查閱相關文獻制備了COFs結構 TpBD(NH2)2，使用后合成修飾的方法，讓葡萄糖修飾到了該材料上，通過“網包法”固載到球型硅膠表面，獲得了高效液相色譜手性固定相。用該固定相對二苯基乙醇酮、華法林和N-(3,5-二硝基苯甲酰)-L-亮氨酸等15種手性物質進行了分離。研究結果表明，本文合成的手性材料能夠使多種手性物質實現不同程度的分離。其中CH3OH/H2O(體積比9∶1)的流動相對4種手性物質起到一定的拆分作用，CH3(CH2)4CH3/(CH3)2CHOH(體積比9∶1)的流動相對11種手性物質有一定的拆分效果。這些結果證明，采用后合成修飾的策略，將手性基團連接到無手性的共價有機框架上是可行的，手性的COFs材料用于液相色譜固定相具有一定的前景。