二苯醚類除草劑降解菌Bacillus sp.Za微生物制劑的研發與初步應用①

滕 曉，沈心怡，張步瑤，羅子軒，趙天卓，徐銘陽，黃 星

二苯醚類除草劑降解菌sp.Za微生物制劑的研發與初步應用①

滕 曉，沈心怡，張步瑤，羅子軒，趙天卓，徐銘陽，黃 星*

(南京農業大學生命科學學院，南京 210095)

以二苯醚類除草劑高效降解菌株sp. Za為材料制備微生物制劑，優化液體制劑保護劑的物質配比，篩選固體制劑的最適材料，對固體制劑進行初步應用并評價其降解效果。研究結果表明：①液體制劑保護劑(0.20%檸檬酸鈉、0.20% 羧甲基纖維素、0.30% KCl)可使活菌數提高35.71%，保存30 d的液體制劑對50 mg/L乳氟禾草靈的降解率為83.50%；②篩選得到豬糞有機肥作為固體制劑的最適材料，保存60 d時固體制劑活菌數為8.26×108cfu/g，對土壤中10 mg/kg乳氟禾草靈的降解率為85.52%；③添加固體制劑可有效緩解乳氟禾草靈殘留對玉米所產生的藥害。

sp. Za；二苯醚類除草劑；乳氟禾草靈；菌劑；微生物修復

農田雜草是一類產生持續性危害的農業有害生物。據統計，每年由草害產生的損失占農作物潛在產量的12%。施用化學除草劑是防治草害的主流方式。化學除草劑在我國三大類農藥市場中所占份額位于首位，占總產量的68.70%[1-2]。其中，二苯醚類除草劑用于闊葉雜草的防除，被廣泛應用于大豆、花生和水稻等多種作物田間。該類除草劑可抑制植物原卟啉氧化酶，進而干擾葉綠素的合成，并破壞細胞膜的完整性，最終導致雜草死亡[3]。

乳氟禾草靈是二苯醚類除草劑的代表品種之一[4]。由于近年來用量逐漸增加，該除草劑在施用后易通過飄移、吸附、沉降等方式產生殘留，污染環境并對動植物有一定毒害。研究發現，乳氟禾草靈易對水生動物產生高度毒性，對浮萍和柵藻等水生植物也具有危害作用[5]。乳氟禾草靈誘導小鼠肝臟中過氧化物酶大量表達，造成肝臟腫瘤。高濃度的乳氟禾草靈會對人體產生傷害，引發癌癥等疾病[6-8]。

目前主要通過微生物降解作用消除乳氟禾草靈在環境中的殘留。微生物強化修復是農業環境污染治理的重要技術手段，通過添加有效的外源降解菌株可以對除草劑污染環境進行原位修復[9]。由單一菌株或復合微生物菌群制備而成的微生物菌劑，能夠高效降解或礦化目標污染物。同時功能微生物在土壤環境中形成局部優勢菌群，可抑制腐敗菌和病原菌的增殖，對改善土壤質量和提高土壤微生物多樣性都有明顯的促進作用[10-12]。以江蘇省太湖地區農藥降解示范為例，該地通過實施農藥殘留降解成套技術有效減少了進入太湖水體的農藥殘留[13]。Zhang等[14-15]篩選到1株二苯醚類除草劑高效降解菌株sp. Za，二苯醚類除草劑主要包括乳氟禾草靈、乙羧氟草醚、氟磺胺草醚和三氟羧草醚等，sp. Za能夠以乳氟禾草靈為唯一碳源進行生長，4 d可將50 mg/L乳氟禾草靈降解94.8%。本研究以sp. Za為出發菌株，設計系列試驗優化液體制劑保護劑配比，篩選固體制劑最佳載體材料，并利用玉米苗期試驗初探固體制劑的修復效果，以期為二苯醚類除草劑的污染修復提供可應用微生物制劑及理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、材料與培養基

供試除草劑乳氟禾草靈購自上海安譜實驗科技股份有限公司(純度98%)。供試菌株sp.Za由本實驗室分離并保藏。供試載體包括泥炭、米糠、秸稈肥、花生殼粉、雞糞有機肥、蚯蚓糞有機肥、豬糞有機肥，均自然風干3 d并過40目篩，121℃高溫滅菌2次后備用。供試玉米品種為美玉4號。供試土壤為黃棕壤，取自南京農業大學牌樓實驗基地(32°03′ N，118°86′ E)，pH 6.92，有效磷14.82 mg/kg，速效鉀104.51 mg/kg，有機質12.66 g/kg，未施用過乳氟禾草靈等除草劑，去表層土及雜物后風干備用。

LB培養基：酵母浸出物5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7.0；無機鹽培養基：NH4Cl 1.0 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，pH 7.0；發酵培養基：葡萄糖9.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO40.9 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，NH4Cl 0.8 g，NaCl 0.6 g，pH 7.0 ～ 7.2。以上分別添加去離子水定容至1 L，固體培養基加入1.8% 的瓊脂。

1.2 液體制劑保護劑篩選試驗

1.2.1 保護劑的單因素優化試驗 在無菌條件下，將Za菌種活化后挑取單菌落于液體LB培養基中，30 ℃、160 r/min培養至對數生長期，按1% 接種量接入100 mL發酵培養基進行發酵培養，作為發酵液。將發酵液分裝至100 mL錐形瓶中，其他條件保持一致，分別添加檸檬酸鈉、乙酸鈉、糊精、羧甲基纖維素、KCl、CaCl2等保護劑，使其終濃度分別為0.10%、0.20% 和0.30%，對照為等體積的無菌水，每組處理設3個重復，常溫避光保存30 d后取樣稀釋涂布平板，計算加入保護劑后的菌株存活提高率。存活提高率(%)=(處理組活菌數–對照組活菌數)/對照組活菌數×100。

1.2.2 保護劑最佳物質組合的篩選 根據單因素優化試驗的結果，將優化出的保護劑分為有機物(A：檸檬酸鈉和乙酸鈉)、穩定劑(B：糊精和羧甲基纖維素)、無機鹽(C：KCl和CaCl2)3類，作為3個因素，每類保護劑選擇上述兩種物質作為兩個水平，每種保護劑在發酵液中的濃度均為0.3%，進行3因素2水平L4(23)的正交試驗。

1.2.3 保護劑最佳物質濃度的篩選 根據上述試驗篩選出的最佳保護劑組合，選擇3種保護劑(A：檸檬酸鈉；B：羧甲基纖維素；C：KCl)作為3種因素，每種保護劑設置3個終濃度(0.10%、0.20% 和0.30%)作為3種水平，進行3因素3水平L9(33)正交試驗篩選最佳物質濃度組合。

1.2.4 液體制劑對Za菌株的保存效果 將篩選的最優保護劑組合添加至Za發酵液中，常溫保存30、60 d后進行梯度稀釋涂布，培養3 d后計算活菌數。

1.2.5 液體制劑對除草劑的降解效果 將篩選的最優保護劑組合添加到Za發酵液中，常溫避光保存30 d后，按照1% 的接種量分別加入到含有終濃度為50 mg/L乳氟禾草靈的20 mL液體無機鹽培養基中，在30 ℃、160 r/min的恒溫搖床中培養3 d后，使用高效液相色譜(HPLC)測定乳氟禾草靈濃度，并計算降解率。

1.3 固體制劑載體篩選試驗

1.3.1 最適固體制劑載體的篩選 Za菌液以1% 接種量接入100 mL液體發酵培養基中，30 ℃、160 r/min培養至對數生長期。菌液5 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌3次，重懸菌體，作為種子液。各取2 g載體加入20 mL滅菌水，30 ℃、160 r/min搖床振蕩24 h，得到載體懸濁液。將100 mL Za種子液接種至5 mL載體懸濁液(108cfu/mL)中，再次振蕩培養，于0、2、4 d取樣測定不同載體處理下的活菌數，判斷載體對菌株生長的影響。試驗設置3個平行。

1.3.2 固體制劑的制備 將各載體自然風干后121 ℃、20 min高溫高壓滅菌2次，無菌條件下準確稱取30 g載體于聚乙烯袋中，按照10 % 添加量將培養至對數生長期的菌株Za(108cfu/mL)添加至不同載體中，混合均勻后在聚乙烯袋表面用滅菌牙簽隨機扎5個孔徑一致的透氣孔，再套一層同樣扎5個透氣孔的聚乙烯袋。成品固體菌劑置于30 ℃培養箱培養，3 d后取出于干燥陰涼處保存待用。

1.3.3 固體制劑對Za菌株的保存效果 將各固體制劑常溫保存0、30、60 d后取樣，按照1.3.1中方法得到菌體懸濁液，分別進行梯度稀釋涂布，30 ℃培養3 d后測定活菌數。

1.3.4 固體制劑對除草劑的降解效果 供試土壤中加入乳氟禾草靈使其終濃度為10 mg/kg，充分混勻后常溫靜置5 h，將固體制劑以1∶9質量比與上述土壤充分混勻，裝入黑色塑料杯中置于光照培養箱，培養條件為：光照12 h，溫度26 ℃，黑暗12 h，溫度20 ℃ (24 h交替進行)。通過補加水分調節土壤含水量在25% ～ 30%，在1、3、5和7 d后分別取5 g土樣檢測乳氟禾草靈殘留量。同時設置不加固體制劑的對照組，對照與處理均設3個重復。

1.4 固體制劑的應用

分別稱取500 g供試土壤于0.7 L盆缽中，玉米種子消毒萌發后，挑取長勢一致的6顆發芽種子移栽至盆缽，設置正常土壤空白對照、10 mg/kg乳氟禾草靈、10 mg/kg乳氟禾草靈+10% 固體制劑的3組處理，置于培養箱中如步驟1.3.4中所述條件培養，其間補加水分調節土壤含水量在25% ～ 30%，14 d后隨機取樣，測定根系長度、莖葉長度、植株鮮重等生理指標。

1.5 測定項目與方法

活菌數測定方法：制備菌株Za的OD600值與菌落數(cfu/mL)的活菌計數標準曲線。挑取菌株Za單菌落于液體LB試管培養基中，30 ℃、180 r/min培養12 h；將Za菌液以2% 接種量接入液體LB三角瓶培養基中，30 ℃、180 r/min培養，每隔2 h取樣測定OD600值，同時以稀釋平板涂布法測定菌落數(cfu/mL)，制備標準曲線。后續活菌數測定試驗根據該標準曲線公式進行計算。

乳氟禾草靈測定方法：取2 mL待測樣品于10 mL離心管中，依次加入15 μL的20% 鹽酸和等體積的二氯甲烷，渦旋振蕩3 min，棄掉上層水相；向有機相中加入過量無水硫酸鈉直至水分完全去除，將有機相轉移至干凈的2 mL離心管中，置于通風櫥中待二氯甲烷吹干；加入400 μL甲醇(色譜純)溶解，通過0.22 μm的有機相濾器過濾至干凈的1.5 mL離心管中，待測。HPLC為Thermo scientific Ultimate 3000，色譜柱為Thermo scientific AcclaimTM 120 C18(5 μm 120 ? 4.6×250 mm)反向色譜柱，流動相為甲醇∶水∶乙酸(80∶19∶1)，柱溫為40 ℃，流速為1 mL/min，檢測波長為230 nm和280 nm，進樣量為20 μL。

植株生理指標測定方法：用無菌水洗滌植株3次，擦干根部和葉表面水分，測量整株重量作為植株鮮重，測量根莖分隔處至主根最遠點的長度作為根系長度，測量根莖分隔處至植株最高點的長度作為莖葉長度。

1.6 數據統計與分析

使用Microsoft Excel TM軟件對數據初步處理，采用SPSS 25.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 液體制劑保護劑的篩選

2.1.1 保護劑的單因素優化試驗 如表1所示，各保護劑在各濃度梯度均能不同程度地提高菌株存活率。隨著保護劑有效使用濃度的提高，各保護劑對菌株的保護效果隨之提高。當有效使用濃度為0.30% 時，無機鹽組(KCl和CaCl2)的保護效果相差不大，提高效果均達到20% 以上，而有機物組(檸檬酸鈉和乙酸鈉)和穩定劑組(糊精和羧甲基纖維素)組分間相差較大，檸檬酸鈉的效果最好，菌株存活提高率為34.18%。因此，設置各物質使用濃度為0.30% 篩選最佳物質組合。

表1 Za液體菌劑保護劑的單因素試驗

注：表中同列不同小寫字母表示同一保護劑下不同濃度處理間在<0.05水平上差異顯著)。

2.1.2 保護劑最佳物質組合的篩選 如表2所示，通過分析極差值發現各因素對菌株Za存活提高率的影響作用順序為：穩定劑(B)>無機鹽(C)>有機物(A)，即穩定劑的影響較為顯著，無機鹽和有機物影響程度次之。綜合分析3種因素的值，其最優水平是A1B2C2，即與其他物質組合相比，檸檬酸鈉、羧甲基纖維素、KCl組合對菌株生長影響最大。由活菌提高率結果可知，該組合對菌株保護效果最佳，菌株存活提高率為27.64%。因此，選擇該組合作為最佳保護劑組合開展后續濃度配比的研究。

2.1.3 保護劑最佳物質濃度的篩選 不同濃度保護劑組合對Za活菌數的提高效果差異明顯。由表3可知，各因素間的主次順序為：A>B>C，最優水平為A2B2C3，即0.20% 的檸檬酸鈉、0.20% 的羧甲基纖維素和0.30% 的KCl，且該濃度組合下的菌株存活提高率為35.71%，保護效果最佳。由此，確定該濃度組合為Za菌株液體制劑保護劑的最佳配比。

表2 菌株Za液體制劑保護劑最佳物質組合正交表

表3 菌株Za液體保護劑的濃度組合正交表

2.1.4 液體制劑對Za菌株的保存效果 對篩選的最佳保護劑組合5進行菌株Za液體制劑的保存試驗。如圖1所示，在沒有保護劑的情況下，活菌數在30 d內即出現明顯下降。而隨著保存期的延長，添加了保護劑(0.20% 檸檬酸鈉、0.20% 羧甲基纖維素和0.30% KCl)的液體制劑保持較高的Za生物量，60 d活菌數仍達到8.19×108cfu/mL，即該保護劑組合可以在儲存期內將活菌數維持在較高水平，從而延長液體微生物制劑的貨架期，確保其在有效期內施用對農藥的降解效果。

(圖中不同小寫字母表示不同樣品間在P<0.05水平上差異顯著，下同)

2.1.5 液體制劑對除草劑的降解效果 將篩選出的Za液體制劑保護劑最佳濃度組合1(0.10% 檸檬酸鈉、0.10% 羧甲基纖維素、0.10% KCl)、組合3(0.10% 檸檬酸鈉、0.30% 羧甲基纖維素、0.30% KCl)、組合4(0.20% 檸檬酸鈉、0.10% 羧甲基纖維素、0.20% KCl)和組合5(0.20% 檸檬酸鈉、0.20% 羧甲基纖維素、0.30% KCl)進行乳氟禾草靈除草劑降解效果的驗證。如圖2所示，加入4種保護劑保存30 d后的Za液體菌劑對乳氟禾草靈的降解效果均顯著高于對照，降解率均保持在70% 以上，其中正交組合5對乳氟禾草靈降解率最高，其降解率可達83.50%。

圖2 不同保護劑組合對Za液體菌劑降解乳氟禾草靈的影響

2.2 固體制劑載體的篩選

2.2.1 最適固體制劑載體的篩選 如圖3所示，向各載體中接種Za菌株后，菌株均可生存及繁殖。儲存4 d后發現豬糞有機肥載體中所含活菌數最高，達到8.88×108cfu/g，秸稈肥所含活菌數較少，為8.18×108cfu/g。豬糞有機肥載體可以為菌體提供良好的環境和營養，有利于菌體的生長繁殖。

2.2.2 固體制劑對Za菌株的保存效果 微生物固體制劑的載體是微生物生存的微環境，篩選能夠最大限度維持微生物活性的載體對菌株制劑的保存效果尤為關鍵。如圖4所示，隨著固體制劑儲存期的延長，幾種載體中的活菌數均呈現不同程度的下降趨勢。30和60 d時，活菌保存效果最好的均為豬糞有機肥，30 d時活菌數達到最高，為8.38×108cfu/g，60 d為8.26×108cfu/g。

(A：泥炭；B：米糠；C：秸稈肥；D：花生殼粉；E：雞糞有機肥；F：蚯蚓糞有機肥；G：豬糞有機肥)

(A：泥炭；B：米糠；C：秸稈肥；D：花生殼粉；E：雞糞有機肥；F：蚯蚓糞有機肥；G：豬糞有機肥)

2.2.3 固體制劑對除草劑的降解效果 圖5為保存30 d后的各制劑載體對乳氟禾草靈7 d內的降解情況。添加各載體后，土壤中乳氟禾草靈降解率均明顯上升。在相同條件下CK處理降解率僅為27.66%，而4組固體制劑的7 d降解率均高于70%，其中以豬糞有機肥為載體的固體制劑降解效果最優，為85.52%。綜合考慮保存期活菌數和降解效果，選擇以豬糞有機肥為載體開展固體制劑的初步應用。

2.3 固體制劑的應用

由表4可知，只添加除草劑處理組在培養期內玉米各指標均顯著低于其他處理，說明乳氟禾草靈對玉米產生了持續的藥害。向含有除草劑殘留的盆缽中加入固體制劑，14 d后，莖葉長度和每株植株鮮重指標恢復至對照水平，可見，施加固體制劑有效降解了土壤中除草劑殘留，減輕了作物所受藥害。

(A：米糠；B：雞糞有機肥；C：豬糞有機肥；D：蚯蚓糞有機肥；圖中不同小寫字母表示同一時間不同處理間差異在P<0.05水平顯著)

表4 Za固體制劑對玉米除草劑藥害的解除作用

注：表中同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(<0.05)。

3 討論與結論

農村勞動力老齡化程度不斷加深，在農業生產中化肥農藥的使用不減反增，農藥殘留污染現狀不容樂觀[16]。本試驗針對二苯醚類除草劑的土壤殘留污染，以高效降解菌株sp. Za為出發菌株開展其微生物制劑的相關研究。通過正交試驗，優化Za液體制劑保護劑的配比，0.20% 檸檬酸鈉、0.20% 羧甲基纖維素和0.30% KCl的物質組合可使液體制劑的有效活菌數提高35.71%，保存30 d后對50 mg/L乳氟禾草靈的降解率為83.50%。影響微生物液體制劑形成市場規模的主要原因在于產品貨架期短，保護劑可以防止微生物制劑雜菌污染，調節滲透壓以穩定菌體，確保高溫、鹽脅迫等不良條件下液體制劑的使用效果[17-19]。

面對土壤這一復雜的生態體系時，固體菌劑的釋放率、抗逆性、傳質性和定殖狀況等均會不同程度地影響使用效果。土壤中少量殘留的二苯醚類除草劑即可對玉米作物產生嚴重藥害，對于幼苗根系抑制尤為強烈。本研究通過盆栽試驗探究Za固體制劑的最適材料，并以玉米為試驗材料研究其實際應用效果。結果表明，豬糞有機肥作為載體材料時，保存60 d活菌數為8.26×108cfu/g，對10 mg/kg乳氟禾草靈土壤降解率為85.52%。受到藥害的玉米幼苗各項生長指標全面落后，而固體制劑的添加可有效減輕藥害程度，其中對作物根系所受藥害的解除效果尤為明顯。

兩種微生物制劑就保存效果看，固體制劑保存60 d后的有效活菌數高于液體制劑，豬糞有機肥載體既提供了良好的附著作用，又利用其本身的有機物質促進了菌體生長。就降解效果看，液體制劑保存30 d仍可達到固體菌劑保存7 d時的降解效率，與文獻報道結果一致，即液體環境能夠最大限度還原降解菌株的修復功能[20]。因此，Za固體制劑適用于對時效性和貨架期要求較高的應用場景，而Za液體制劑則更注重滿足降解要求。綠色生產關乎國家糧食安全和人民生計提升，更是自然生態與社會體系應對環境變化的重要環節[21]。本研究從土壤環境生態修復出發，探索不同類型微生物制劑的制備方案，可為除草劑高效降解菌株的產品化開發和規模化應用提供技術支持和理論依據。

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Development and Preliminary Application of Microbial Preparation of Diphenyl Ether Herbicede Degrading Strainsp. Za

TENG Xiao, SHEN Xinyi, ZHANG Buyao, LUO Zixuan, ZHAO Tianzhuo, XU Mingyang, HUANG Xing*

(College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

sp. Za, a biodegradable strain with diphenyl ether herbicide, was used as the material to prepare microbial preparation. The material ratio of liquid protective agent was optimized, and the most suitable material for solid preparation was screened. The results showed that: 1) The protective agent of liquid preparation (0.20% sodium citrate, 0.20% carboxymethyl cellulose, 0.30% KCl) increased the number of viable bacteria by 35.71%, and the degradation rate of 50 mg/L lactofen in liquid preparation stored for 30 days was 83.50%. 2) The optimum material for solid preparation of pig manure organic fertilizer was obtained. After 60 days of storage, the viable bacteria count of solid preparation was 8.26×108cfu/g, and the degradation rate of 10 mg/kg lactofen in soil was 85.52%. 3) Adding solid preparation can effectively alleviate the drug damage caused by the residue of lactofen on maize.

sp. Za; Diphenyl ethers herbicides; Lactofen; Microbial agent; Microbial remediation

X172

A

10.13758/j.cnki.tr.2023.03.026

滕曉, 沈心怡, 張步瑤, 等. 二苯醚類除草劑降解菌sp. Za微生物制劑的研發與初步應用. 土壤, 2023, 55(3): 682–688.

國家自然科學基金項目(41977119)，江蘇省重點研發計劃項目(BE2020692)和江蘇省農業科技自主創新資金項目(CX(22)3136)資助。

(huangxing@njau.edu.cn)

滕曉(1998—)，女，山東濟寧人，碩士研究生，主要從事環境微生物學研究。E-mail: tengxiao98@qq.com