雌激素相關受體a對腦膠質瘤細胞耐受替莫唑胺的影響

張留弟 王天笑 陳海飛 李群益 施孝金

摘 要 目的：探究雌激素相關受體a對腦膠質瘤細胞耐受替莫唑胺（temozolomide，TMZ）的調控作用及其機制。方法：建立耐受TMZ的膠質瘤細胞株，并構建膠質瘤裸鼠移植模型；從離體和在體層面分析特異性敲減ERRa或使用ERRα反向激動劑XCT790對耐藥膠質瘤細胞增殖的影響；并結合熒光定量PCR實驗檢測Wnt通路相關基因的表達。結果：敲減ERRα或給予XCT790均顯著抑制耐藥膠質瘤細胞增殖，并抑制Wnt5a信號通路關鍵基因的表達，動物模型中XCT790聯用TMZ可有效抑制耐受TMZ的膠質瘤細胞生長。結論：抑制ERRa功能可逆轉膠質瘤細胞對替莫唑胺的耐藥性，這一作用可能與抑制Wnt5a信號通路的功能密切相關。

關鍵詞 雌激素相關受體a 膠質瘤 替莫唑胺 XCT790 Wnt5a

中圖分類號：R73-3； R739.41 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2023）11-0051-05

引用本文 張留弟， 王天笑， 陳海飛， 等. 雌激素相關受體a對腦膠質瘤細胞耐受替莫唑胺的影響[J]. 上海醫藥， 2023， 44（11）： 51-55.

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81973399）；國家自然科學基金青年科學基金項目（81901399）；上海市衛生健康委員會科研基金項目（20184Y0194， 20204Y0445）

Effect of estrogen-related receptor α on temozolomide resistance in glioma cell

ZHANG Liudi， WANG Tianxiao， CHEN Haifei， LI Qunyi， SHI Xiaojin

（Department of Pharmacy， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the regulatory effect and mechanism of estrogen-related receptor a （ERRa） on temozolomide resistance in glioma cells. Methods： A temozolomide （TMZ） resistant glioma cell line and a nude mouse model of glioma orthotopic transplantation were established. The effects of specific ERRa knockdown or the use of the ERRα reverse agonist XCT790 on the proliferation of TMZ-resistant glioma cells were analyzed in vitro and in vivo. The expression of Wnt pathway-related genes was detected by fluorescence quantitative PCR. Results： Knocking down ERRa or administration of XCT790 could significantly inhibit the proliferation of TMZ-resistant glioma cells and the expression of the key genes in Wnt5a signaling pathway， and prolong the survival period of model animals. Conclusion： Inhibition of ERRa function can reverse TMZ resistance in glioma cells， which may be closely related to inhibiting the function of Wnt5a signaling pathway.

KEY WORDS estrogen related receptors a； glioma； temozolomide； XCT790； Wnt5a

腦膠質瘤是成年人顱內最常見、惡性程度最高及預后情況最差的腫瘤[1]。其中膠質母細胞瘤（glioblastoma， GBM， WHO Ⅳ級）是惡性程度最高的腦膠質瘤，發病率約為3.2/10萬，在所有膠質瘤患者中占46.1%[2]。目前治療方案以手術切除為主。但由于膠質瘤細胞生長迅速，侵襲能力強，與正常腦組織無明顯界限，且瘤體分布較為分散，手術很難徹底清除腫瘤病灶，因此術后須結合放化療。在臨床化療用藥中，替莫唑胺（temozolomide， TMZ）的應用最為廣泛。TMZ為咪唑并四嗪類具有抗腫瘤活性的第二代口服烷化劑，是目前臨床治療腦膠質瘤的標準一線化療藥[3]。多項國際大型隨機對照研究證實，膠質瘤患者手術后服用TMZ同步進行放化療，相比于術后單純放療的病人，中位數生存期由12個月提高到14.6個月，其中部分患者術后生存期達到5年以上[4-5]。證實了術后通過化療可以進一步殺滅殘存腫瘤細胞，有助于提高患者無進展生存期和總生存期。然而在臨床治療過程中后期，部分患者對替莫唑胺的敏感性逐漸降低，腫瘤復發概率提升，導致疾病根治難度加大[6]。因此，尋找一種有效降低膠質瘤患者對TMZ耐藥性的方案對腫瘤治療和延長患者生存周期至關重要。

雌激素相關受體a（estrogen-related receptor a，ERRa）在體內廣泛表達，參與調控組織器官發育、細胞衰老、腫瘤發生和發展等[7]。近年來，大量研究揭示ERRα的表達與乳腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、胃腺癌和膠質瘤等腫瘤疾病的發生發展和臨床預后密切相關[8-9]。杜克大學的McDonnell等[10]的研究證實，ERRa反向激動劑可以抑制線粒體的功能從而抑制乳酸的利用，特異性導致腫瘤細胞的持續凋亡，并顯著增敏PI3K抑制劑或者PI3K/mTOR雙重抑制劑的體內抗腫瘤活性，因此，聯合應用ERRa拮抗劑/反向激動劑可能成為新的抗腫瘤治療策略。本研究擬通過建立耐受TMZ的膠質瘤細胞株，并構建膠質瘤裸鼠原位移植模型；從細胞到動物層面評估特異性敲減ERRa或使用ERRa反向激動劑XCT790對逆轉膠質瘤細胞耐受TMZ的潛力，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞和動物

人類神經膠質瘤細胞系U87和U251購自中國科學院細胞庫。構建膠質瘤裸鼠原位移植模型所用雄性裸鼠（BALB/c nude）購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

1.1.2 試劑

XCT 790（HY-10426）、TMZ（HY-17364）均購自MedChemExpress公司；上海吉凱基因生物技術有限公司提供了本研究使用的ERRα敲減慢病毒載體和陰性對照品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

兩種膠質瘤細胞均在添加10%澳洲胎牛血清（翌圣生物科技有限公司）和100 U/mL青霉素/鏈霉素（碧云天生物技術有限公司）的最低必需培養基（中橋新舟生物技術有限公司）中培養。細胞在含有5% CO2和95%空氣的濕化培養箱中于37 ℃培養。

為了探究ERRα對耐受TMZ的神經膠質瘤細胞的治療作用，我們參考先前研究建立耐受TMZ的膠質瘤細胞系[11]。U87和U251細胞分別用低濃度TMZ（10 mmol/L）作為初始濃度，TMZ劑量每2周增加1倍，直到藥物濃度達到640 mmol/L。

1.2.2 細胞活力測定

使用細胞計數試劑盒-8（CCK-8，Proteintech Group公司）進行細胞活力測定。將膠質瘤細胞以6×103個細胞/孔的密度接種到96孔板中，并在標準培養條件下孵育24 h。藥物處理后，將10 μL/孔CCK-8試劑加入96孔板中，并在37 ℃下孵育1 h。使用多功能酶標儀在450 nm處檢測光密度（OD）值。每個實驗均獨立進行了3次，每次實驗有5份重復。

1.2.3 熒光定量PCR測定

膠質瘤細胞實驗處理后，利用RNA提取試劑盒（康為生物技術有限公司）從細胞中分離總RNA。使用逆轉錄試劑盒（Takara生物技術公司）將2 mg總RNA逆轉錄成cDNA。并在ABI 7500 PCR系統（Applied Biosystems公司）中使用SYBR Green PCR試劑盒（Takara生物技術公司）進行定量實時逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）反應。為了標準化檢測基因的表達水平，利用GAPDH基因作為內參進行檢測。檢測基因的引物序列設計參考RTPrimerDB數據庫 （http：//medgen.ugent. be/rtprimerdb/）。

1.2.4 建立膠質瘤裸鼠異種移植模型

雄性BALB/c裸鼠（6～8周齡，22 g）背部皮下注射2×106個U87 TMZ耐藥細胞，建立膠質瘤異種移植模型。膠質瘤細胞植入后每天給予藥物治療，并在第5天開始，每隔5 d記錄瘤體生長情況并繪制腫瘤生長曲線，移植瘤體積[V（cm3）]=0.5×L×S2（L，移植瘤最大長徑cm，S移植瘤橫徑cm）。實驗開始后第30天處死動物對瘤體進行稱重。

1.2.5 統計學分析

使用GraphPad Prism 7.0和SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析。單因素方差分析和Dunnetts post-hoc檢驗比較實驗中的組間差異。在分析之前，所有數據都經過了Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗和Levene檢驗。Compusyn軟件用于繪制Chou-Tallay等劑量圖評估XCT790與TMZ聯合用藥的協同作用。數據以平均值±標準差表示。P<0.05提示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 建立膠質瘤TMZ耐藥細胞株

TMZ已被證實是膠質瘤的一線化療藥物，可以延長患者生存期。然而，連續使用TMZ治療引起的獲得性化療抵抗嚴重限制了治療效果，成為膠質瘤患者治療失敗的主要原因。我們通過長期給予梯度增高的TMZ，建立對TMZ耐藥的膠質瘤細胞株。并利用CCK-8檢測TMZ在親本細胞和耐藥細胞中IC50的變化情況。結果顯示，U87親本細胞TMZ IC50為796 mmol/L，而耐藥細胞TMZ IC50達到了2 314 mmol/L，提高了約2.9倍；U251親本細胞TMZ IC50為434 mmol/L，耐藥細胞TMZ IC50為1 138 mmol/L，提高了約2.6倍（圖1）。這些結果證實我們成功建立了對TMZ耐藥的膠質瘤細胞株。

2.2 敲減ERRα逆轉膠質瘤細胞對TMZ的耐藥性

在已建立的對TMZ耐藥的膠質瘤細胞基礎上，我們利用慢病毒轉染的手段，特異性敲減耐藥細胞株的ERRα表達，并觀察敲減ERRα是否影響TMZ的治療效果。結果顯示，敲減ERRα后，U87 TMZ耐藥細胞的TMZ IC50降低了45.6%，而U251 TMZ耐藥細胞的TMZ IC50降低了35.5%（圖2），證實敲減ERRα可顯著逆轉膠質瘤細胞對TMZ的耐藥性。

2.3 XCT790與TMZ聯合用藥對膠質瘤治療具有協同作用

之前的研究結果已經敲減ERRα可有逆轉膠質瘤細胞對TMZ的耐藥性，我們推測ERRα特異性反向激動劑XCT790與TMZ聯合治療耐藥膠質瘤細胞能發揮協同作用，并采用了Chou-Talay聯合用藥協同分析方案來評估協同作用效果。利用梯度濃度XCT790和指定濃度的TMZ處理膠質瘤細胞24 h，組合指數（CI）小于1表明XCT790和TMZ的組合具有協同作用。結果顯示，XCT790和TMZ的組合協同產生了膠質瘤抗TMZ的活性（CI<1.0，圖3）。這一結果證實，XCT790與TMZ的協同用藥方案對治療TMZ耐藥的膠質瘤具有較大潛力。

2.4 ERRα調控TMZ耐藥膠質瘤細胞WNT通路相關基因表達

為了探究ERRα對膠質瘤TMZ耐藥調控的機制，我們利用PCR對給予XCT790（2 mmol/L）和敲減ERRα后U87 TMZ耐藥細胞株Wnt5a、GSK3β、Axin、APC、β-catenin基因表達進行檢測，結果表明，給予XCT790和敲減ERRα均降低U87耐藥細胞株Wnt通路相關基因的表達（圖4）。

2.5 XCT790抑制TMZ耐藥的膠質瘤異種移植小鼠瘤體生長

基于我們在體外研究中的發現，有理由認為XCT790在體內同樣具有逆轉膠質瘤對TMZ耐藥性的作用。為了驗證XCT790對TMZ耐藥的膠質瘤的治療作用，我們在裸鼠中建立了TMZ耐藥膠質瘤細胞異種移植模型。12只模型動物等分為3組，空白對照組動物給予溶劑對照，TMZ治療組每日腹腔注射100 mg/kg TMZ，聯合治療組在給予TMZ治療的基礎上額外給予20 mg/kg的XCT790。結果顯示，與單用TMZ治療組相比，XCT790+TMZ治療組模型動物移植瘤生長速度和瘤體重量均顯著降低（圖5）。

3 討論

本研究發現，敲減ERRα能有效逆轉膠質瘤細胞TMZ耐藥；接著又證實了ERRα反向激動劑XCT790聯用TMZ在離體和在體實驗中對TMZ耐藥的膠質瘤細胞的治療均體現出顯著協同作用。進一步研究發現，敲減ERRα和XCT790聯用逆轉膠質瘤對TMZ耐藥性的作用可能與抑制耐藥細胞中Wnt5a信號通路密切相關。以上結果證實了抑制ERRα功能可逆轉膠質瘤細胞對TMZ耐藥性，這一作用可能與抑制Wnt5a信號通路的功能密切相關。

作為極具潛力的抗腫瘤藥物靶點，近年來，關于ERRα的研究受到極大關注。ERRα全長423個氨基酸，其編碼基因位于人染色體11q13位點，全長約20 kb，包括7個外顯子和6個內含子。ERRα在體內廣泛表達，從心肌、消化道、大腦、骨骼肌、棕色脂肪以及乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤等均能檢出。ERRα以二聚體形式與雌激素反應元件結合來發揮其生物學效應，還能以單體形式與雌激素相關受體反應元件結合。ERRα對于代謝靶基因的精確調控在機體的能量代謝中起著重要的作用。ERRα在機體中參與的代謝過程主要有：糖代謝、脂代謝、線粒體氧化代謝、自適應能量代謝等。這些功能的發揮與組織器官的發育、細胞的衰老、腫瘤的發生和發展等密切相關。ERRα在多種腫瘤中過表達，如乳腺癌、卵巢癌、膠質瘤、前列腺癌、結直腸癌、宮頸癌、子宮內膜癌等，而且與腫瘤的迅速發展、預后不良密切相關[12-14]。

近年來，由Wnt5a所調控的Wnt信號通路在神經膠質瘤中的作用引起了廣泛關注，為膠質瘤靶向治療提供了新思路。Wnt信號轉導通路常見于胚胎發育和某些正常生理過程，并參與了干細胞的多能性維持或分化，以及細胞增殖。迄今為止，已發現至少19個Wnt家族成員。其中， Wnt5a在腫瘤的發生發展中發揮多種功能，其在組織中可對細胞的遷移、侵襲及血管的生成產生影響，并且對組織的修復和維持組織的穩態起著極其重要的作用。Wnt5a既能作用于經典的Wnt/β-catenin通路，又能活化非經典的Wnt/Ca2+及Wnt/PCP通路。近期研究表明，Wnt5a在膠質瘤中高表達，并與惡性膠質瘤侵襲性、病情進展及預后不良顯著相關[15-16]。Wnt5a通過結合Ryk受體，調控MMP-2表達促進膠質瘤侵襲與浸潤[17]。Wnt5a還參與了膠質瘤上皮間質轉化[18]。

總體而言，我們的研究明確了抑制ERRα功能可有效逆轉膠質瘤對TMZ的耐藥性，這一作用可能與抑制耐藥膠質瘤細胞Wnt5a信號通路的功能密切相關。這一發現為膠質瘤耐受TMZ問題的解決提供了新的思路和見解。

參考文獻

[1] Louis DN， Ohgaki H， Wiestler OD， et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system[J]. Acta Neuropathol， 2007， 114（2）： 97-109.

[2] Dimitrov L， Hong CS， Yang C， et al. New developments in the pathogenesis and therapeutic targeting of the IDH1 mutation in glioma[J]. Int J Med Sci， 2015， 12（3）： 201-213.

[3] Hombach-Klonisch S， Mehrpour M， Shojaei S， et al. Glioblastoma and chemoresistance to alkylating agents： involvement of apoptosis， autophagy， and unfolded protein response[J]. Pharmacol Ther， 2018， 184： 13-41.

[4] Stewart LA. Chemotherapy in adult high-grade glioma： a systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomised trials[J]. Lancet， 2002， 359（9311）： 1011-1018.

[5] Stupp R， Hegi ME， Mason WP， et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase Ⅲ study： 5-year analysis of the EORTCNCIC trial[J]. Lancet Oncol， 2009， 10（5）： 459-466.

[6] Messaoudi K， Clavreul A， Lagarce F. Toward an effective strategy in glioblastoma treatment. Part Ⅱ： RNA interference as a promising way to sensitize glioblastomas to temozolomide[J]. Drug Discov Today， 2015， 20（6）： 772-779.

[7] 陸蘊紅，李群益，施孝金. 雌激素相關受體a（ERRa）與腫瘤疾病的研究進展[J]. 復旦學報（醫學版）， 2014， 41（1）： 126-132.

[8] Ranhotra HS. The estrogen-related receptor alpha： the oldest， yet an energetic orphan with robust biological functions[J]. J Recept Signal Transduct Res， 2010， 30（4）： 193-205.

[9] Suzuki T， Miki Y， Moriya T， et al. Estrogen-related receptor alpha in human breast carcinoma as a potent prognostic factor[J]. Cancer Res， 2004， 64（13）： 4670-4676.

[10] Park S， Chang CY， Safi R， et al. ERRa-regulated lactate metabolism contributes to resistance to targeted therapies in breast cancer[J]. Cell Rep， 2016， 15（2）： 323-335.

[11] Munoz JL， Rodriguez-Cruz V， Greco SJ， et al. Temozolomide resistance in glioblastoma cells occurs partly through epidermal growth factor receptor-mediated induction of connexin 43[J]. Cell Death Dis， 2014， 5（3）： e1145.

[12] Tam IS， Giguere V. There and back again： the journey of the estrogen-related receptors in the cancer realm[J]. J Steroid Biochem Mol Biol， 2016， 157： 13-19.

[13] Gandhari MK， Frazier CR， Hartenstein JS， et al. Identification and characterization of estrogen receptor-related receptor alpha and gamma in human glioma and astrocytoma cells[J]. Mol Cell Endocrinol， 2010， 315（1-2）： 314-318.

[14] Zhang L， Zhu Y， Cheng H， et al. The increased expression of estrogen-related receptor alpha correlates with wnt5a and poor prognosis in patients with glioma[J]. Mol Cancer Ther， 2019， 18（1）： 173-184.

[15] Zhang L， Liu P， Chen H， et al. Characterization of a selective inverse agonist for estrogen related receptor alpha as a potential agent for breast cancer[J]. Eur J Pharmacol， 2016， 789： 439-448.

[16] Du Y， Song L， Zhang L， et al. The discovery of novel， potent ERR-alpha inverse agonists for the treatment of triple negative breast cancer[J]. Eur J Med Chem， 2017， 136： 457-467.

[17] Ning Y， Chen H， Du Y， et al. A novel compound LingH2-10 inhibits the growth of triple negative breast cancer cells in vitro and in vivo as a selective inverse agonist of estrogenrelated receptor alpha[J]. Biomed Pharmacother， 2017， 93： 913-922.

[18] Binda E， Visioli A， Giani F， et al. Wnt5a drives an invasive phenotype in human glioblastoma stem-like cells[J]. Cancer Res， 2017， 77（4）： 996-1007.