糖代謝異常與甲狀腺疾病伴發時外周血Treg和Th17細胞的變化

沈 艷，李文花，龍密密，譚玉潔

（1.六盤水市人民醫院檢驗科，貴州 六盤水 553000；2.貴州醫科大學附屬醫院臨床檢驗中心，貴州 貴陽 550004）

甲狀腺疾病是甲狀腺功能、大小或組織結構發生改變的一組疾病的總稱，是臨床上常見的內分泌疾病。糖代謝異常是機體葡萄糖代謝發生異常的一類疾病，包括糖尿病前期和糖尿病。糖尿病和甲狀腺疾病的發病與遺傳、環境及自身免疫等多種因素有關，但具體病因目前尚未明確。臨床研究表明，糖尿病與甲狀腺疾病之間存在一定的聯系，糖尿病患者中甲狀腺功能異常的發生率明顯升高，是非糖尿病患者的2 ～3 倍，介于12.5% ～51.6% 之間，其原因未明。研究證實，Th1/Th2 失衡與甲狀腺疾病的發生發展有關。Th17 細胞主要分泌白細胞介素-17（IL-17），在各種傳染性疾病、癌癥和自身免疫性疾病的發生發展中起著重要的作用。Treg 細胞是一種具有免疫調節功能的免疫抑制性T 細胞。糖尿病合并甲狀腺功能異常者在臨床上較為常見，本研究采用流式細胞術檢測糖代謝異常與甲狀腺疾病患者外周血Treg 和Th17 細胞的變化，探討糖代謝異常與甲狀腺疾病之間的免疫學聯系。

1 資料與方法

1.1 基線資料

選取貴州醫科大學附屬醫院門診及住院的糖代謝異常患者78 例、甲狀腺疾病患者60 例進行研究。糖代謝異常分類符合1999 年世界衛生組織（WHO）糖尿病專家委員會提出的糖尿病的診斷標準，甲狀腺功能異常依據《中國甲狀腺疾病診治指南》進行診斷。將78 例糖代謝異常患者納入GM 組，將60 例甲狀腺疾病患者納入TD 組。GM 組中，男45 例，女33 例，平均年齡（47.53±15.68）歲。TD 組中，男20 例，女40 例，平均年齡（45.00±12.57）歲。另選擇我院同期健康體檢者20 例為對照組（NC 組），其中男8 例，女12 例，平均年齡（46.15±13.44）歲。三組的年齡、性別相比，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。糖代謝異常患者根據甲狀腺功能檢查結果分為糖代謝異常伴甲狀腺功能正常者58 例（納入GM-TN 組）和糖代謝異常伴甲狀腺功能異常者20 例（納入GM-TD組）。甲狀腺疾病患者根據糖代謝檢查結果分為甲狀腺疾病伴糖代謝正常者47 例（納入TD-NGM 組）和甲狀腺疾病伴糖代謝異常者13 例（納入TD-AGM 組）。

1.2 主要試劑與儀器

CD4-FITC、CD25-PE-Cy ?7、IL-17A-PE、A-Fluor 647-CD127（均為鼠抗人），同型對照FITC Mouse IgG1，κ Isotype Control RUO、Alexa Fluor?647 Mouse IgG1 κ Isotype Control RUO、PE Mouse IgG1，κ Isotype Control RUO、PE-Cy ?7 Mouse IgG1 κ Isotype Control RUO、溶血素和刺激劑+ 蛋白轉運抑制劑，均為美國BD 公司生產。FACS Canto Ⅱ流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 所有研究對象均隔夜禁食8 ～12 h，以EDTA-K2 真空抗凝采血管采集清晨空腹靜脈血2 mL，混勻，室溫保存，用于檢測Treg 細胞和Th17 細胞的表達。

1.3.2 Treg 細 胞 檢 測 取CD4-FITC、A-Fluor 647-CD127 各5 μL 及CD25-PE-Cy?7 1.25 μL，加入50μL EDTA-K2 抗凝血，振蕩混勻后，室溫避光孵育30 min。加入溶血素1 mL，振蕩混勻后，室溫溶血5 min，然后再置于37 ℃恒溫水浴箱中溶血5 min。待血融透后，加入3 mL PBS，振蕩混勻后用低速離心機離心（1500 r/min 下離心5 min），洗滌兩次，加入0.3 mL PBS 重懸細胞，混勻，上機檢測。收集20 000 個淋巴細胞，采用Flowj0 7.6 軟件分析CD4+CD25+CD127low細胞占CD4+T 細胞的百分比（Treg/CD4+T%）。

1.3.3 Th17 細胞檢測 用人淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（PBMC），加入PBS 至1 mL，重懸細胞，混勻備用。取出24 孔細胞培養板，每孔加入1 mL含10% FBS 的1640 培養基。加入上述制備好的細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/mL，用槍吹打混勻，再加入2 μL 刺激劑+蛋白轉運抑制劑，吹打混勻，置于37 ℃、5% 的CO2培養箱中培養刺激6 ～8 h ；用PBS 在1500 r/min 下離心5 min，洗滌兩次，加入10 μL 的CD4-FITC，4 ℃避光孵育30 min。用PBS在1500 r/min 下離心5 min，洗滌2 次，加入固定/破膜劑1 mL，顛倒混勻，4 ℃避光孵育1 h，用固定/破膜洗液在1500 r/min 下離心5 min，洗滌2 次，加入10μL 的IL-17A-PE，4 ℃避光孵育50 min。加入固定/ 破膜洗液1 mL，在1500 r/min 下離心5 min，洗滌2 次，加入300 μL 的PBS 重懸細胞，上機檢測。每管收集20 000 個淋巴細胞，采用Flowj0 7.6 軟件分析CD4+IL-17A+ 細胞占CD4+T 細胞百分比（Th17/CD4+T%）。

1.4 觀察指標

觀察并比較各組的外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 GM 組、TD 組、NC 組外周血Treg、Th17細胞及Treg/Th17 的比較

與NC 組比較，GM 組和TD 組的外周血Treg/Th17均降低，Treg 和Th17 細胞均升高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 GM 組、TD 組、NC 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17的比較（± s）

表1 GM 組、TD 組、NC 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17的比較（± s）

注：**與NC 組比較，P ＜0.01。

組別 Treg 細胞（%）Th17 細胞（%）Treg/Th17（%）GM 組（n=78）4.67±1.04** 1.49±0.38** 3.28±0.96**TD 組（n=60）4.89±1.09** 1.50±0.46** 3.45±1.13**NC 組（n=20）3.62±0.64 0.83±0.19 4.54±1.19

2.2 GM-TN 組、GM-TD 組外周血Treg、Th17細胞及Treg/Th17 的比較

與GM-TN 組比較，GM-TD 組的外周血Treg 細胞和Treg/Th17 均降低（P＜0.05）；兩組的外周血Th17細胞相比無統計學差異（P＞0.05）。詳見表2。

表2 GM-TN 組、GM-TD 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的比較（± s）

表2 GM-TN 組、GM-TD 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的比較（± s）

注：*與GM-TN 組比較，P ＜0.05。

組別 Treg 細胞（%）Th17 細胞（%）Treg/Th17（%）GM-TN 組（n=58）4.79±1.17 1.45±0.39 3.46±0.99 GM-TD 組（n=20）4.35±0.32* 1.62±0.30 2.77±0.58*

2.3 TD-NGM 組、TD-AGM 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的比較

TD-NGM 組和TD-AGM 組的外周血Treg、Th17細胞及Treg/Th17 比較均無統計學差異（P＞0.05）。詳見表3。

表3 TD-NGM 組、TD-AGM 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的比較（± s）

表3 TD-NGM 組、TD-AGM 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的比較（± s）

注：＃與TD-AGM 組比較，P ＞0.05。

組別 Treg 細胞（%）Th17 細胞（%）Treg/Th17（%）TD-NGM 組（n=47）4.90±1.03＃ 1.53±0.48＃ 3.43±1.07＃TD-AGM 組（n=13）4.82±1.34 1.37±0.38 3.74±1.33

2.4 GM-TD 組、TD-AGM 組外周血Treg、Th17細胞及Treg/Th17 的比較

與TD-AGM 組比較，GM-TD 組外周血的Th17細胞升高，Treg/Th17 降低（P＜0.05）；兩組的外周血Treg 細胞相比無統計學差異（P＞0.05）。詳見表4。

表4 GM-TD 組、TD-AGM 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的比較（± s）

表4 GM-TD 組、TD-AGM 組外周血Treg、Th17 細胞及Treg/Th17 的比較（± s）

注：*與TD-AGM 組比較，P ＜0.05。

Treg/Th17（%）GM-TD 組（n=20）4.35±0.32 1.62±0.30* 2.77±0.58*TD-AGM 組（n=13）4.82±1.34 1.37±0.38 3.74±1.33組別 Treg 細胞（%）Th17 細胞（%）

3 討論

Treg 細胞由Sakaguchi 等在1995 年首次報道，隨后的研究發現Treg 細胞能分泌多種具有免疫調節功能的細胞因子，抑制效應T 細胞的免疫應答，與多種免疫性疾病的發病機制或免疫狀態密切相關，在維持免疫穩態和調控免疫應答方面具有重要作用[1-2]。Th17 細胞由Harrington 和Park 等發現，它是一種不同于Th1、Th2 的新型CD4+T 細胞，主要分泌IL-17，受轉錄因子RORrt 的分化調控，在各種傳染性疾病、癌癥和自身免疫性疾病的發生發展中起著重要的作用[3]。近年來的研究表明，糖尿病是以高血糖為主要特征的低度炎癥性疾病，而炎癥的發生與免疫狀態密切相關，已陸續有研究報道糖尿病的發生與免疫功能紊亂有關。另一方面，有研究發現甲狀腺疾病患者可出現Treg 細胞數量減少、功能降低及Th17 細胞增加的情況，提示甲狀腺疾病的發生同樣與機體免疫紊亂有關[4]。本研究觀察了GM 組、TD 組與NC 組外周血Treg 細胞和Th17 細胞的變化，結果顯示GM 組與TD組的外周血Treg 細胞和Th17 細胞均升高，二者的比值Treg/Th17 均降低。國內外的研究顯示，Th17 細胞在糖尿病中表達上升，增加的Th17 細胞可分泌效應因子，調節多種致炎因子的水平，從而引起糖尿病患者的胰島β 細胞損害和死亡；在甲狀腺疾病中，Th17細胞表達也處于活躍狀態，被激活的Th17 細胞分泌效應因子，作用于甲狀腺組織細胞，誘發并加重局部炎癥反應，導致甲狀腺濾泡上皮細胞逐漸被破壞。效應因子還可以活化轉化因子NF-κB，誘導T 細胞的增殖與活化，參與炎癥反應，導致甲狀腺自身抗體的產生。據報道，Treg 細胞對機體的免疫保護機制減弱可增強慢性炎癥的刺激及增加炎性因子的分泌，導致胰島素敏感性進一步減弱，引起糖尿病的發生發展。而Treg 細胞對Fas 介導的凋亡細胞易感性增加，導致Treg 細胞數量減少，從而抑制免疫調節功能活化自身反應性T 細胞，導致甲狀腺疾病的發生。但一些研究則表明，甲狀腺疾病中Treg 細胞數量無明顯改變。有研究發現，Treg 細胞在糖尿病發病初期會增加[5]。

糖尿病和甲狀腺疾病都屬于內分泌疾病，兩者之間存在一定的關聯，且糖尿病患者中甲狀腺功能異常的發生率明顯升高，是非糖尿病患者的2 ～3 倍。有研究發現，甲狀腺疾病中甲亢患者的血糖水平及血糖異常的發生率均高于健康體檢組[6]。甲狀腺疾病發生時，甲狀腺激素對胰島功能有雙重影響，既改變機體對胰島素的敏感性，又改變胰島素的降解速度。甲狀腺激素升高，胰島β 細胞功能減低，胰島素抵抗增加，導致糖尿病加重。研究表明，甲狀腺激素引起的胰島β 細胞凋亡是糖代謝異常患者早期胰島β 細胞死亡的主要病理機制[7]。本研究中我們發現，與糖代謝異常伴甲狀腺功能正常組比，糖代謝異常伴甲狀腺功能異常組的外周血Treg 細胞和Treg/Th17 均降低，Th17 細胞升高，提示甲狀腺功能異常可進一步加重糖代謝異常患者的免疫功能紊亂及體內的炎癥反應。甲狀腺激素的異常分泌可破壞胰島β 細胞，促進胰島炎癥反應，使其炎癥反應增強，這進一步證實了甲狀腺疾病的發生與免疫功能損傷密切相關。本研究對甲狀腺疾病伴糖代謝正常與甲狀腺疾病伴糖代謝異常患者進行了比較，發現兩組的免疫細胞差異無統計學意義。提示甲狀腺疾病患者血糖升高并非免疫因素導致，而是甲狀腺激素對胰島功能的雙重影響導致。我們對糖代謝異常伴甲狀腺功能異常與甲狀腺疾病伴糖代謝異常患者進行比較發現，前者的Th17 細胞升高，而Treg/Th17 降低，證實了這兩組患者并非罹患相同的疾病，而是兩個不同的疾病組，至少也是處于疾病的不同階段。

綜上所述，臨床實踐中應充分重視糖代謝異常與甲狀腺疾病之間密切的免疫學聯系，除被免疫細胞作用的主要靶器官不同外，兩者均與機體細胞免疫缺陷和體液免疫過度激活有關，均存在外周血Treg/Th17平衡的異常，且糖代謝異常伴甲狀腺疾病時機體的免疫調節異常更加嚴重。因此，針對糖代謝異常患者應重視甲狀腺功能檢查，并關注其有無免疫功能紊亂及炎癥反應，以便更好地開展治療。