5-氨基酮戊酸光動力療法對增生性瘢痕成纖維細胞TGF-β1/Smads信號通路的影響

盧 娜，梁棟龍，李 靜，余南生

（佛山市順德區樂從醫院，廣東 佛山 528315）

增生性瘢痕是一種纖維化皮膚病，增生性瘢痕組織會對皮膚的美觀和功能產生嚴重影響，給患者造成不同程度的心理負擔，影響其生活質量。為此，國內外對增生性瘢痕的研究都非常重視。傳統的治療方法包括手術、打磨、冷凍、壓迫、外用藥物、激素封閉等，但效果并不理想。5- 氨基酮戊酸光動力療法（5-ALA-PDT）是近年來的一種新的治療方式，在皮膚科的應用較為多樣化，包括在腫瘤皮膚科、感染性皮膚科和皮膚美容科都有應用。該療法優點突出，如療效好、安全性高、患者耐受性好等，且應用范圍廣泛，有較好的治療和美容效果。從增生性瘢痕中成纖維細胞的病理生理學來看，5-ALA-PDT 可用于治療增生性瘢痕。近年來，國內有學者研究了光動力療法在體外對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響[1]，也有學者測試了光動力療法在動物中治療增生性瘢痕的適用性[2]，均取得了較好的試驗結果。研究發現，成纖維細胞增殖可過度產生膠原纖維，主要為Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維，而抑制這兩種膠原纖維的產生可有效治療增生性瘢痕[3]。本研究就5-ALA-PDT 對增生性瘢痕成纖維細胞轉化生長因子-β1（TGF-β1）/Smads 信號通路的影響進行分析，現將研究方法和結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 基線資料

選取2020 年1 月至2022 年8 月我院收治的增生性瘢痕患者66 例作為研究對象。病例納入標準：（1）有不同程度和類型的增生性瘢痕的臨床表現：皮膚傷口愈合后疤痕擴散并突出于皮膚表面，不規則，凹凸不平，伴發紅、阻塞、發硬、發熱、發癢、發緊等；（2）年齡25 ～35 歲；（3）在研究開始前1 個月內停用其他藥物；（4）知悉研究內容，并簽署知情同意書。病例排除標準：（1）合并嚴重的心、肝、腎疾病；（2）治療依從性差；（3）對5-ALA-PDT 不耐受。將患者分為對照組和研究組，各33 例。研究組中，男10 例，女23 例，平均年齡（29.68±4.78）歲。對照組中，男12 例，女21 例，平均年齡（28.67±4.57）歲。兩組基線資料相比，差異無統計學意義（P＞0.05）本研究得到了醫院倫理委員會的批準，并已向有關部門報告和登記。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 用5- 氨基酮戊酸（5-ALA，上海復旦張江生物醫藥有限公司）和BIOF 水合凝膠配制成20% 的凝膠溶液對研究組進行光動力治療。在治療前，將患者安置在黑暗的房間內40 min，用清水沖洗局部皮膚，然后遮陽20 min。治療時讓患者戴上護目鏡，在距離皮膚15 cm 處接受波長為（633±3）mm、能量為128 J 的紅光照射治療。治療后，用薄膜包裹患處，外用無菌紗布覆蓋，4 h 后拆除敷料，囑患者在24 h 內避免強光照射患處。給予對照組單純激光治療，半導體激光器的輸出功率為100 mW/cm2，總能量為40 ～50 J/cm2，波長為635 nm，每次治療30 min。兩組均每5 d 治療1 次，共治療6 次。

1.2.2 成纖維細胞培養 切開瘢痕組織，切取皮下組織，在平衡鹽水中切成0.5 cm×0.5 cm 的小塊，在膠原酶溶液中切割1 h，以200 目尼龍網過濾，離心過濾細胞液，棄去上清液，加入DMEM 培養基繼續培養，用第4 ～8 代細胞進行測試。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗 采用酶聯免疫吸附試驗測定不同濃度（0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L）ALA對成纖維細胞TGF-β1、基質金屬蛋白酶1（MMP-1）分泌的影響。將胰蛋白酶消化的單層培養細胞接種在96 孔培養板的1.0×104孔中，培養48 h 后，在96 孔板中加入不同濃度（分別為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L）的ALA，并加入無血清的DMEM 培養液，分別在燈光下照射20 min 作為對照組。將培養物在無ALA 和僅有光照的CO2培養箱中培養4 h，并加入含有10% 血清的培養基。24 h 后，采用酶聯免疫吸附試驗測定成纖維細胞在不同濃度ALA 下分泌的TGF-β1、MMP-1 的含量。

1.2.4 Western Blot 法 采 用Western Blot 法 檢 測MAPK 信號通路中ERK、JNK 和P38 的水平，按文獻[4]報道的方法進行檢測。

1.3 觀察指標

（1）觀察研究組治療前后成纖維細胞的狀態。（2）觀察不同濃度5-ALA 對成纖維細胞增殖能力的影響。通過MTT 比色法檢測細胞的增殖率來確定成纖維細胞的增殖能力，A 值越低說明5-ALA 對成纖維細胞增殖的抑制作用越顯著。（3）觀察不同濃度5-ALA對成纖維細胞前膠原（包括Ⅰ前膠原/β-actin、Ⅲ前膠原/β-actin）mRNA 表達的影響。（4）觀察5-ALA對MAPK 信號通路中ERK、JNK 和P38 的影響。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件處理各項數據，計數資料、計量資料分別用%、±s表示，分別行χ2、t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組治療前后成纖維細胞狀態的觀察

治療前，顯微鏡下觀察研究組的成纖維細胞：細胞間隔緊密，呈放射狀，細胞核呈圓形或橢圓形，核仁不一，細胞質向兩極突出，細胞核為淺藍色，細胞質為粉紅色；用5-ALA 進行光動力處理后，顯微鏡下觀察到成纖維細胞為橢圓形或圓形，細胞間連接松散，失去正常細胞排列，在線粒體和粗面內質網中觀察到了超微結構的變化。

2.2 不同濃度5-ALA 對成纖維細胞增殖能力的影響

研究組在0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L濃度的5-ALA 下，成纖維細胞增殖能力的A 值分別為（0.215±0.011）、（0.215±0.011）、（0.188±0.007）。詳見表1。對照組成維細胞增殖能力的A 值為（0.244±0.011）。研究組不同濃度5-ALA 下成纖維細胞的增殖能力均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 研究組不同濃度5-ALA 對成纖維細胞增殖能力的影響（n=33）

2.3 不同濃度5-ALA 對成纖維細胞前膠原mRNA表達的影響

研究組不同濃度5-ALA 對成纖維細胞前膠原（包括Ⅰ前膠原/β-actin、Ⅲ前膠原/β-actin）mRNA 表達的影響不同，且均低于對照組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 不同濃度5-ALA 對成纖維細胞前膠原mRNA 表達的影響（± s）

表2 不同濃度5-ALA 對成纖維細胞前膠原mRNA 表達的影響（± s）

注：*與對照組相比，P ＜0.05；β-actin 為β- 肌動蛋白。

指標 研究組（n=33）對照組（n=33）0.25（mmol/L）0.5（mmol/L）1.0（mmol/L）2.0（mmol/L）Ⅰ前膠原/β-actin 0.847±0.151* 0.737±0.126* 0.721±0.115* 0.694±0.051* 1.337±0.054*Ⅲ前膠原/β-actin 0.763±0.105* 0.551±0.063* 0.548±0.035* 0.527±0.015* 1.145±0.036*

2.4 不同濃度5-ALA 對成纖維細胞TGF-β1、MMP-1 分泌的影響

通過體外細胞培養，給予不同濃度5-ALA 測定發現，與對照組的TGF-β1、MMP-1（23.4±1.3）ng/L、（409.5±10.2）ng/L 相 比，研 究 組0.5 mmol/L、1.0 mmol/L 濃度的5-ALA 對TGF-β1的分泌起到抑制作用，對MMP-1 的分泌則起到誘導作用。詳見表3。

表3 不同濃度5-ALA 對成纖維細胞TGF-β1、MMP-1分泌的影響（n=33，ng/L，± s）

表3 不同濃度5-ALA 對成纖維細胞TGF-β1、MMP-1分泌的影響（n=33，ng/L，± s）

指標 0.25 mmol/L 0.5 mmol/L 1.0 mmol/L TGF-β1 17.5±1.6 15.1±1.0 14.6±0.9 MMP-1 601.4±10.3 802.3±11.4 895.7±11.3

2.5 5-ALA 對MAPK 信號通路中ERK、JNK 和P38 的影響

用適當濃度的5-ALA 處理細胞，輻照1 h 后收集細胞，提取蛋白質，采用Western Blot 法測定MAPK 信號通路中ERK、JNK 和P38 的水平，結果發現，在研究組中，觀察到MAPK 家族的信號在0.5 mmo/L時明顯增強，與對照組相比，ERK（44 ku）、P38（38 ku）和JNK（46 ku）分別增加了113.0%、36.0% 和67.0%（P＜0.05）。

3 討論

增生性瘢痕是一種纖維化皮膚病，其特點是成纖維細胞增殖和膠原纖維（主要的細胞外基質）的過度形成，導致膠原細胞外基質大量異常沉積，引起局部皮膚畸形和功能障礙。Smad 蛋白是TGF-β 信號通路中重要的受體后信使，TGF-β1與相應的受體結合并發揮生物效應，TβR Ⅰ、TβR Ⅱ和TβR Ⅲ具有信號傳導所必需的Ser/Thr 蛋白激酶活性。具有Ser/Thr 蛋白激酶活性的跨膜信號受體對信號傳導至關重要，它參與受體下游的細胞內信號傳導[4]。被激活的TGF-β 受體通過蛋白分子（如Smads）調節目標基因的表達，Smads 將細胞內的信號級聯到轉錄的細胞核。TGF-β1通過調節不同的細胞外基質成分來調節細胞外基質的形成（細胞內轉錄或轉錄后水平）和表達，并通過調節水解酶的形成和活性抑制細胞外基質的代謝。成纖維細胞分泌的TGF-β1是瘢痕形成過程中細胞外基質蛋白合成的重要刺激因子。增生性瘢痕的傳統治療方法包括手術、磨削、冷凍、壓縮、局部用藥和激素封閉等，但效果并不理想[5]。由于增生性瘢痕中的成纖維細胞比正常皮膚細胞有更強的積累光敏劑的能力，故可通過在非熱激光和光敏劑存在的情況下對其進行照射來達到治療的目的。光敏劑吸收光能并進入激發狀態，在此狀態下光敏劑將能量傳回給氧氣，產生活性氧和自由基，對瘢痕組織成纖維細胞的生物膜造成氧化損傷，最終導致細胞凋亡和壞死。5-ALA 作為第二代光敏劑，很容易被瘢痕組織中的成纖維細胞吸收，并由ALA 脫水酶和一系列的酶轉化為強效的光敏劑，如原卟啉IX（PpIX），在特定光的照射下它通過產生活性氧和自由基來傷害目標細胞。研究發現，ALA 的濃度影響瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和膠原蛋白Ⅲ的表達，其抑制作用隨著濃度和光照時間的增加而增加[6]。本研究結果也表明，增生瘢痕組織中的成纖維細胞在采用5-ALA 進行光動力治療后形態發生了顯著改變：體外培養的成纖維細胞呈正常的貝殼狀，壁附著良好，細胞核大，細胞質完整，邊界清晰；5-ALA 濃度超過一定界值時，細胞形態的折疊隨著濃度的增加而增加。另一方面，隨著5-ALA濃度的增加，成纖維細胞細胞膜和細胞壁的破裂增加，細胞質過度充盈，細胞核減少或碎裂，出現不同大小的細胞質顆粒。5-ALA-PDT 治療增生性瘢痕的原理主要是：活躍增殖的目標細胞比周圍的正常細胞具有更大的積累光敏劑的能力，通過使用特定波長的光在合適的時間照射目標細胞，能誘發一系列的生化反應，破壞活躍增殖細胞的生物膜，進而達到滅活的目的[7]。研究顯示，5-ALA-PDT 對增殖性瘢痕成纖維細胞和成纖維細胞前膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的基因表達在不同濃度下存在差異性，且對第4 ～第8 代原代培養的成纖維細胞的TGF-β1/Smads 信號通路確實存在影響[8]。

本 研 究 發 現，0.5 mmol/L、1.0 mmol/L 濃 度的5-ALA 對TGF-β1的分泌起到了抑制作用，對MMP-1 的分泌起到了誘導作用。可能的原因是：MMP-1 是一種正常存在于人體內的蛋白酶，其生理功能是降解膠原Ⅳ，早期MMP-1 的分泌增加促進了膠原Ⅳ的重塑；TGF-β1能促進膠原蛋白的合成，改善皮膚老化；光敏劑能明顯增加細胞的光吸收性，增強細胞的應激反應，誘導細胞凋亡，從而抑制TGF-β1的分泌。但人體內是否存在一種機制來對抗MMP-1 的異常增加或激活補償途徑需要進一步研究。本研究中，在研究組中觀察到MAPK 家族的信號在0.5 mmo/L 時明顯增強，與對照組相比，ERK（44 ku）、P38（38 ku）和JNK（46 ku）分別增加了113.0%、36.0% 和67.0%（P＜0.05）。主要原因是：一方面，一定量的5-ALA 可能誘導細胞凋亡或細胞死亡，這種作用可能抵消ERK 的增殖作用，或為補償性激活；另一方面，5-ALA 影響其他兩個與應激有關的MAPK 激酶，即JNK 和P38，它們相互作用，共同決定細胞的反應。相關報道指出，ALA 可能通過刺激P38 和激活JNK 來抑制成纖維細胞的增殖[9]。本研究中，5-ALA-PDT 對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的抑制作用是在MTT 試驗中檢測到的，在0.25 ～2.0 mmol/L的濃度范圍內，抑制作用隨著5-ALA 濃度的增加而增加，在5-ALA 濃度為0.5 mmol/L 時達到高峰[10-11]。

綜上所述，采用5-ALA-PDT 治療增生性瘢痕可取得一定的成效。5-ALA-PDT 可通過抑制Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白基因的合成來抑制增生性瘢痕中成纖維細胞的增殖，并對TGF-β1起到抑制作用，對MMP-1 起到誘導作用，同時觀察到MAPK 信號通路在濃度為0.5 mmo/L 的5-ALA 下增強，該濃度可作為5-ALA-PDT 治療增生性瘢痕的參考濃度。