丹參酮ⅡA對脂多糖誘導人腎皮質近曲小管損傷的影響研究

詹樹煜，黃 薇，陳文良

（廣東省中醫院，廣東 廣州 510120）

丹參酮ⅡA 是從中藥丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）中提取出的一種重要的脂溶性單體[1]。研究表明，丹參酮ⅡA 具有良好的抑制腫瘤的藥理作用，其主要是通過抑制血管生成來抑制腫瘤[2]。在中醫臨床上，丹參是一味常用于治療腎臟疾病的中藥，亦有研究顯示其具有抑制腎臟炎癥的作用[3]。腎皮質近曲小管是腎皮質中占比最多的細胞[4]。當致炎因素刺激腎臟時，腎皮質近曲小管會出現凋亡，釋放促炎因子，參與腎臟的炎癥病理改變[5]。然而丹參酮ⅡA 對腎皮質近曲小管細胞活力和炎癥的作用目前尚待進一步闡明。本研究旨在探究丹參酮ⅡA 對體外人腎皮質近曲小管的影響作用。

1 研究方法

1.1 主要材料

丹參酮ⅡA 購自成都瑞芬思（純度≥98%）；脂多糖購自Sigma 公司（CAT#L2630）；CCK8 試劑盒購自大連美侖（CAT#MA0218、MA0186）；DMEM/F12 基礎培養基、細胞培養用青霉素/ 鏈霉素和0.25%含EDTA 胰酶購自Gibco 公司（CAT#C11330500BT、10378016、25200072）；胎 牛 血 清 購 自BI 公 司（CAT#04-001-1ACS）。RNA 提取試劑、反轉錄試劑 盒、SYBR 染 料 購 自AG 公 司（CAT# AG21102、AG11728、AG11718）。

1.2 人腎皮質近曲小管細胞系（HK-2）的培養與干預

HK-2 細胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司（CL-0109）。細胞用完全培養基（DMEM/F12+10%胎牛血清+1% 青霉素/ 鏈霉素）在5% CO2、37℃的培養箱中培養。當細胞匯合度約為90%時，應用0.25%胰蛋白酶以1:3 的比例進行傳代培養。

1.3 CCK8 實驗

將細胞以5×103顆/ 孔的密度均勻播種在96 孔板中，每孔加100 μL 的完全培養液，置入培養箱中培 養24 h。次 日 給 予0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL 的脂多糖或0、2.5、5、10、20、40、80 μM的丹參酮ⅡA（溶于DMSO）干預22 h。每孔加10 μL的CCK8 溶液混勻，繼續避光孵育2 h。在全波長酶標 儀（Thermo Fisher Scientific, Multiskan GO 1510）中檢測450 nm 波長處的吸光度。

1.4 細胞總RNA 提取

將細胞以1.5×105顆/ 孔的密度均勻播種在96孔板中，每孔加2 mL 的完全培養液，置入培養箱中培養24 h。次日給予空白對照組、脂多糖組（4 μg/mL）、丹參酮ⅡA 低劑量組（4 μg/mL 脂多糖+20 μM 丹參酮ⅡA）、丹參酮ⅡA 高劑量組（4 μg/mL 脂多糖+40 μM丹參酮ⅡA）對應干預。24 h 后以PBS 潤洗3 次，加入500 μL/ 孔的RNA 提取試劑，并遵照試劑盒說明書進行總RNA、合成cDNA 的提取。

1.5 實時熒光定量PCR 實驗（qPCR）

委托上海生工公司合成TNF-α（正義鏈：5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG，反 義 鏈：5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG）、IL-1β（正義 鏈：5’-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA，反義鏈：5’-GTCGGAGATTCGTAGCTGGA）和β-actin（正義鏈：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，反義鏈：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC）。按照SYBR 染料試劑盒說明書配置試劑，并加入1 μL 濃度為1 μg/μL的cDNA，最后按說明書設定運行程序進行實時熒光定量分析（ABI, QuantStudio ? 5）。

1.6 統計學檢驗

運用SPSS 26.0 統計軟件進行統計檢驗，所有數據均以±s表示。兩組間比較進行t檢驗，當P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的脂多糖及丹參酮ⅡA 對HK-2 細胞活力的影響

本研究通過給予不同濃度的脂多糖干預來觀察脂多糖對腎小管上皮細胞形態及活力的影響。結果顯示，隨著脂多糖干預濃度梯度的上升，HK-2 的細胞存活率逐步上升，并在4 μg/mL 濃度時達到最高的增殖率（見圖1A）。梯度給予不同濃度的丹參酮ⅡA 后，與空白對照組相比，大于10 μM 濃度的丹參酮ⅡA 組出現明顯的細胞抑制（見圖1B）。結果表明，脂多糖會導致HK-2 異常增殖，而丹參酮ⅡA 具有抑制HK-2增殖的作用。

圖1 不同濃度脂多糖及丹參酮ⅡA 對HK-2 的影響

2.2 丹參酮ⅡA 對脂多糖誘導HK-2 細胞活力的影響

為探索丹參酮ⅡA 對脂多糖誘導的HK-2 細胞活力的影響，我們進一步檢測了脂多糖聯合丹參酮ⅡA干預后HK-2 細胞活力及形態上的改變。結果顯示，與脂多糖干預組相比，給予20、40、80 μM 丹參酮ⅡA 時細胞異常增殖率出現明顯下降（見圖2A）。形態學觀察顯示，空白對照組細胞透光均勻，細胞密度約60%，細胞呈飽滿圓形。脂多糖組的細胞形態變為不規則狀，透明度不均一，細胞密度達到90%以上（見圖2B）。相較于脂多糖組，給予丹參酮ⅡA（40 μM）后，細胞的密度有一定程度的下降，細胞的透光度有一定的改善。結果表明，10 μM ～80 μM 的丹參酮ⅡA 能改善脂多糖誘導的HK-2 細胞異常增殖及形態異常。

圖2 丹參酮ⅡA 對脂多糖誘導HK-2 炎癥模型細胞活力及形態的影響

2.3 丹參酮ⅡA 對脂多糖誘導的HK-2 細胞炎癥的影響

為了進一步探究丹參酮ⅡA 對HK-2 炎癥的影響，本研究通過qPCR 檢測了脂多糖及丹參酮ⅡA 干預后HK-2 中炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的表達（見圖3A、B）。結果顯示，給予脂多糖干預后，HK-2的炎癥因子表達水平明顯上升，表明細胞炎癥損傷模型造模成功。與脂多糖組相比，給予丹參酮ⅡA 后，細胞炎癥因子的表達水平明顯下降，且呈劑量依賴性，表明丹參酮ⅡA 能抑制細胞模型的炎癥。

圖3 丹參酮ⅡA 對脂多糖誘導的HK-2 細胞炎癥的影響

3 討論

目前，丹參酮ⅡA 已有應用于臨床的制劑—丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液，其主要用于治療心腦血管相關的疾病，例如冠心病、腦供血不足、動脈閉塞癥等[6]。有研究指出，丹參酮ⅡA 是具有明確藥理活性的單體，具有良好的臨床療效。腎臟是血管、血流豐富的臟器，從傳統中醫藥或現代藥理學的角度看，丹參酮ⅡA 治療腎臟疾病都具備理論基礎。本研究進一步提供了實驗數據的支持。研究發現，丹參酮ⅡA 對脂多糖誘導的人腎皮質近曲小管細胞系HK-2 的炎癥損傷具有抑制作用，并可保護細胞活力。目前已有文獻報道了丹參酮ⅡA 對急性腎損傷、糖尿病腎病等腎臟疾病的作用機制[7-8]。這些研究表明，丹參酮ⅡA 對腎臟具有保護作用。本研究從對體外腎皮質近曲小管影響的角度進一步分析了丹參酮ⅡA 的作用，有助于揭示丹參酮ⅡA 的腎臟保護作用機制。

綜上所述，本研究有助于明確丹參酮ⅡA 對腎臟保護作用的機制，可為丹參酮ⅡA 用于治療腎臟疾病提供參考依據，從而可擴大其臨床適應癥范圍。