不同氮源、磷源對鏈狀裸甲藻生長與酶活性的影響*

史競園 劉 云 張櫻馨 張緒濤 宋書群 李才文, 3, 4

不同氮源、磷源對鏈狀裸甲藻生長與酶活性的影響*

史競園1, 3劉 云1, 2張櫻馨1, 3張緒濤1, 3宋書群1, 2李才文1, 2, 3, 4①

(1. 中國科學院海洋研究所 中國科學院海洋生態與環境科學重點實驗室 山東青島 266071; 2. 嶗山實驗室 海洋生態與環境科學功能實驗室 山東青島 266237; 3. 中國科學院大學 北京 100049; 4. 中國科學院海洋大科學研究中心 山東青島 266071)

為揭示鏈狀裸甲藻()對不同氮源和磷源營養條件的適應機制, 通過在不同營養鹽濃度和形態條件下對鏈狀裸甲藻進行一次性培養, 探究了氮源、磷源對鏈狀裸甲藻生長和酶活性的影響。結果顯示, 鏈狀裸甲藻可在多種形態氮和磷的條件中生存, 其中鏈狀裸甲藻在氮濃度0～800 μmol/L范圍內對NH4Cl的親和性最高, 在磷濃度0～32 μmol/L范圍內對三磷酸腺苷(ATP)的利用能力最低。不同氮形態處理組中, 培養初期谷氨酰胺合成酶在NH4Cl為氮源的條件下活性表達最強; 培養中后期, 谷氨酰胺合成酶和脲酶在尿素為氮源條件中表達最高, 而各處理組中的硝酸還原酶活性均較低, 表明鏈狀裸甲藻在低硝酸鹽環境中沒有競爭優勢。不同磷形態處理中, 各組堿性磷酸酶活性隨培養時間先升高后降低, 酸性磷酸酶活性(除ATP處理組外)逐漸降低。ATP為磷源的處理組具有最高的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性, 其他三個處理組酶活性表達相似。研究發現不同氮源和磷源顯著影響鏈狀裸甲藻的生長, 藻細胞可通過調節谷氨酰胺合成酶、脲酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性對不同形態營養鹽進行利用, 研究結果為闡釋鏈狀裸甲藻對復雜營養條件的適應機制及其赤潮發生機制提供了重要參考。

鏈狀裸甲藻; 氮源; 磷源; 藻生長; 酶活性

氮、磷作為許多生物活性物質的主要組成成分, 在海洋生命活動中起著非常重要的作用, 是浮游植物生長的營養鹽限制因子(Yamamoto, 2004; Lee, 2012; Liu, 2015)。海洋中的氮和磷主要以無機態和有機態兩種形式存在, 浮游植物可以直接吸收利用無機態營養鹽, 也可以通過酶的作用水解有機態營養鹽為無機態后再吸收(Oh, 2002; 張清春等, 2005)。其中, 參與氮同化的關鍵酶主要有硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)和脲酶(urease, UE), 硝酸還原酶參與硝態氮的還原過程, 是藻細胞同化硝氮過程中的第一步; 谷氨酰胺合成酶催化銨氮的轉氨基作用從而將銨氮轉化為藻細胞可利用的氨基酸; 脲酶是將尿素催化水解轉化為氨及氨基甲酸酯的重要酶, 這三種酶的活性通常被用于評價海洋浮游植物生長狀態(Mobley, 1989; Iriarte, 2005; Berges, 2008; 鐘娜等, 2008; Solomon, 2010)。此外, 浮游植物可以通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AkP)水解胞外有機態磷, 酸性磷酸酶(acid phosphatase, AcP)水解胞內磷來同化磷, 維持正常的生命活動(王艷等, 2006; 趙艷芳等, 2009)。

鏈狀裸甲藻()隸屬于甲藻綱, 裸甲藻目, 裸甲藻科, 裸甲藻屬, 是已有報道中唯一一種可產生麻痹性貝類毒素的裸甲藻(Bolch, 2002; Cembella, 2018)。麻痹性貝類毒素可在食物鏈中傳遞, 通過堵塞肌纖維Na+通道抑制神經傳導, 導致動物及人類中毒甚至死亡(Wang, 2016)。在中國近海, 鏈狀裸甲藻營養細胞及孢囊分布廣泛(Qi, 1996; Gu, 2013), 自2005年至今, 共引發赤潮12次(中國海洋生態環境狀況公報, 2003～2018年), 其中在2017年的福建海域造成嚴重的中毒事件, 給當地水產養殖業帶來巨大的經濟損失(陳火榮, 2018; 梁玉波等, 2019)。可見, 鏈狀裸甲藻已成為危害我國近海生態健康與食品安全的常見赤潮藻。

目前, 已有研究表明不同海域的鏈狀裸甲藻藻株生長特性存在差別(Yamamoto, 2002; Lim, 2005), 而關于我國福建沿海鏈狀裸甲藻藻株的生長特性的研究尚未見報道。因此, 本文通過比較不用形態氮源和磷源對鏈狀裸甲藻生長和相關酶活性的影響, 探究其對不同氮源和磷源的適應性, 為揭示我國近海鏈狀裸甲藻赤潮的發生機制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用鏈狀裸甲藻分離自福建廈門灣, 由國家海洋局第三海洋研究所提供。藻種采用f/2+Se培養基進行培養(Doblin, 2000)。培養溫度為(20.0±0.1) °C,光暗比為12h︰12h, 光照強度約為70 μmol/(m2·s)。培養所用海水取自青島太平灣海域, 鹽度為30.0±0.1, 經0.22 μm孔徑混合纖維膜過濾后, 121 °C高溫滅菌30 min后使用。

1.2 實驗方法

取指數生長期的鏈狀裸甲藻藻液, 按照起始密度為400 cells/mL分別接種于180 mL的海水中, 饑餓48 h用于后續實驗。

1.2.1 生長實驗 不同氮源培養組分別以NaNO3、NaNO2、NH4Cl、尿素為唯一氮源, 其他元素按照f/2+Se培養基配方添加。設置6個氮濃度: 0、25、50、100、200和800 μmol/L (按氮濃度計)。不同磷源培養組分別以NaH2PO4、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、β-甘油磷酸(β-G-P)和三磷酸腺苷(ATP)為唯一磷源, 其他元素按照f/2+Se培養基配方添加。設置6個磷濃度: 0、2、4、8、16和32 μmol/L (按磷濃度計)。具體實驗設置見表1。每個處理組設置3個平行, 每日多次搖晃, 防止藻細胞貼壁下沉。隔日于固定時間取1 mL藻液, 經Lugol’s碘液固定, 在倒置顯微鏡(SZ61, Olympus, 日本)下對藻細胞進行計數。

表1 各培養組中的氮、磷形態及濃度

Tab.1 Species and concentrations of N and P in different treatment groups

1.2.2 酶活實驗 氮源培養組分別以NaNO3、NaNO2、NH4Cl、尿素為唯一氮源, 設置氮濃度為100 μmol/L, 其他元素按照f/2+Se培養基配方添加, 每個處理組設置9個平行。在第4、8、12天取藻液50 mL, 之后在4 °C, 3 000下離心5 min收集藻細胞,加入相應試劑盒中緩沖液后于4 °C下以3 m/s速度勻質化處理60 s。然后于4 °C 8 000 r/min下離心5 min, 取上清液用于氮相關酶活測定。硝酸還原酶采用硝酸還原酶活性檢測試劑盒(索萊寶, 北京)進行測定, 谷氨酰胺合成酶采用谷氨酰胺合成酶試劑盒(科銘生物, 蘇州)進行測定; 脲酶采用土壤脲酶試劑盒(南京建成, 南京)進行測定。測定過程均按照試劑盒說明進行。

磷源培養組分別以NaH2PO4、G-6-P、β-G-P和ATP為唯一磷源, 設置磷濃度為32 μmol/L, 其他元素按照f/2+Se培養基配方添加, 每個處理組設置9個平行。分別在第4、10、16天取藻液50 mL, 之后在4 °C, 3 000下離心5 min收集藻細胞, 加入相應試劑盒中緩沖液后于4 °C下以3 m/s勻質化處理60 s。然后于4 °C 8 000 r/min下離心5 min, 取上清液用于堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性測定。兩種酶的檢測分別使用堿性磷酸酶活性測定試劑盒和酸性磷酸酶活性測定試劑盒(科銘生物, 蘇州)按照說明進行。

1.3 數據處理

本研究采用的比生長率()計算公式為:

式中,為鏈狀裸甲藻的比生長率, 單位: d–1;0和C分別為初始0時刻的細胞密度和經過時間后t時刻的細胞密度, 單位: cells/mL。

采用米氏方程擬合鏈狀裸甲藻比生長率與營養鹽濃度的關系(Monod, 1958):

式中,為鏈狀裸甲藻比生長率, 單位: d–1;m為鏈狀裸甲藻最大比生長率, 單位: d–1;為初始營養鹽濃度, 單位: μmol/L;K為半飽和常數, 單位: μmol/L, 其值為=m/2時的營養鹽濃度。

不同處理組藻最大細胞密度、比生長率及酶活性差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統計(SPSS 20.0), 采用Origin Pro 2021軟件對數據進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 不同氮源對鏈狀裸甲藻生長的影響

不同氮源對鏈狀裸甲藻生長的影響如圖1所示。4種氮源均可促進鏈狀裸甲藻的生長, 但生長狀況不同。除0 μmol/L添加組外, 其余各組藻細胞均在接種后的第2天進入指數生長期。以NaNO3、NaNO2和尿素作為氮源時, 細胞密度均隨著初始氮濃度的增加而增加(<0.01), 當濃度為800 μmol/L時達到最高值, 分別為11 638、10 326和3 630 cells/mL。而以NH4Cl為氮源時, 在氮濃度0～100 μmol/L范圍內, 細胞密度隨初始氮濃度增加而增加, 100 μmol/L時達到最高值6 000 cells/mL (<0.01); 200和800 μmol/L氮添加組的藻細胞在培養開始后迅速下降, 于第4天時降至0 cells/mL。

圖1 不同氮形態和濃度條件下鏈狀裸甲藻的生長曲線

不同氮濃度對鏈狀裸甲藻的比生長率有顯著影響。在NaNO3處理組中, 鏈狀裸甲藻的比生長率隨初始氮濃度的增加而增大, 最大為0.26 d-1。當以NaNO2、NH4Cl和尿素作為氮源時, 比生長率在0～ 100 μmol/L的范圍內隨氮濃度的增加而增大, 其最大值出現在NaNO2處理組中為0.29 d-1, 較高氮濃度處理組(200和800 μmol/L)中比生長率較低, 分別為0.27和0.25 d-1(NaNO2處理組), 0.15和0.12 d-1(尿素處理組)。鏈狀裸甲藻的生長符合米氏方程, 擬合結果顯示(表2), 最大比生長率(μ)的范圍是0.147～0.297 d-1, NaNO3處理組最高; 半飽和常數(K)的范圍是1.691～23.948 μmol/L, NaNO2處理組最大, NH4Cl處理組最小, 偏好系數()的最小值為0.005 (NaNO3處理組), 最大值為0.118 (NH4Cl處理組)。

表2 不同氮形態條件下鏈狀裸甲藻的營養吸收動力學參數比較

Tab.2 Growth kinetic parameters of G. catenatum grown in different nitrogen sources

注:m為最大比生長率;K為半飽和常數;為偏好系數, 等于m和K的比值;2為擬合優度

2.2 不同磷源對鏈狀裸甲藻生長的影響

不同磷源條件下鏈狀裸甲藻的生長如圖2所示。結果表明, 4種磷源均可促進鏈狀裸甲藻的生長, 在NaH2PO4、G-6-P和ATP處理組中, 0～32 μmol/L濃度范圍內, 細胞密度均呈現隨磷濃度增加而增加的趨勢, 其最大細胞密度分別為11 638、9 353、9 530 cells/mL。當以β-G-P為磷源時, 細胞密度在磷濃度0～16 μmol/L的范圍內隨磷濃度增加而增加, 32 μmol/L處理組最大細胞密度與16 μmol/L處理組無顯著差異(>0.05)。

不同磷濃度影響鏈狀裸甲藻的比生長率。在NaH2PO4和β-G-P處理組中, 鏈狀裸甲藻的比生長率隨磷濃度的增加而增加, 在32 μmol/L組中達到最大值,分別為0.25和0.28 d-1; 以G-6-P為磷源時, 比生長率的范圍是0.04～0.23 d-1, 其中最大值出現在8 μmol/L組; 在ATP處理組中, 在0～16 μmol/L范圍內比生長率隨著磷濃度增加而增大, 最大值為0.25 d-1, 而在32 μmol/L處理組中略有下降。鏈狀裸甲藻在不同磷處理組中的生長符合米氏方程, 擬合結果(表3)顯示, β-G-P處理組的μ值最高, 為0.257 d-1; G-6-P處理組的μ值最低, 為0.229 d-1。ATP處理組的半飽和常數(K)最大, 為1.517 μmol/L; G-6-P處理組的半飽和常數(K)最小, 為0.665 μmol/L。偏好系數()的最高值出現在β-G-P處理組為0.385, 最低值出現在ATP處理組為0.160。

圖2 不同磷形態和濃度條件下鏈狀裸甲藻的生長曲線

表3 不同磷形態條件下鏈狀裸甲藻的營養吸收動力學參數比較

2.3 不同氮磷形態對鏈狀裸甲藻酶活的影響

不同氮形態處理組中, 鏈狀裸甲藻谷氨酰胺合成酶,脲酶和硝酸還原酶的酶活性隨時間變化如圖3所示。結果表明, 各組谷氨酰胺合成酶活性變化趨勢相似, 呈現出隨著培養時間延長而下降的趨勢, 培養第4天時, NH4Cl處理組的谷氨酰胺合成酶活性顯著高于其他組(2.42×10–6U/cell,<0.05), 培養第8天時,尿素處理組的酶活性則顯著高于其他處理組(1.64×10–6U/cell,<0.05), 而NaNO3處理組的酶活性最低(0.78×10–6U/cell), 培養至第12天時, 尿素處理組的酶活性依舊顯著高于其他組(1.40×10–6U/cell,<0.05), 而NH4Cl處理組的酶活性最低(0.53×10–6U/cell)。脲酶活性在NaNO2和尿素處理組中隨培養時間先上升后下降, 而在NH4Cl和NaNO3處理組中先下降后上升, 其中在培養第8天時, 各組酶活性差異顯著(<0.05), 最高值(795.69×10–6U/cell)出現在尿素處理組, 最低值(150.38×10–6U/cell)出現在NaNO3處理組中; 在培養第12天時, 尿素處理組的酶活性顯著高于其他處理組, 為652.09×10–6U/cell (<0.05)。實驗中, 硝酸還原酶活性界于0.08×10–8～2.40×10–8U/cell, 各處理組的硝酸還原酶活性無顯著差異(>0.05)。

圖3 不同氮源對鏈狀裸甲藻氮同化酶活性的影響

注: 谷氨酰胺合成酶活性定義: 每個細胞在每mL反應體系中每小時產生1 μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸為一個活力單位(U); 脲酶活性定義: 每個細胞每小時產生1 μg NH3-N為一個活力單位(U); 硝酸還原酶活性定義: 每個細胞每小時消耗1 μmol NADH為一個活力單位(U)。*<0.05, **<0.01。

在不同磷形態條件下, 鏈狀裸甲藻堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性隨培養時間變化如圖4所示。結果表明, 在不同磷形態處理組中, 鏈狀裸甲藻的堿性磷酸酶活性變化趨勢相似, 即藻細胞的堿性磷酸酶活性在生長第10天達到最大值, 其中ATP處理組的堿性磷酸酶活性最高(28.92×10–6U/cell), NaH2PO4處理組的堿性磷酸酶活性最低(11.26×10–6U/cell); 第16天各培養組堿性磷酸酶活性最低。酸性磷酸酶活性在ATP處理組中呈現出相似的趨勢, 即在第10天達到最高值(2.03×10–6U/cell),第4天的活性次之, 第16天活性最低。而其余三個處理組中酸性磷酸酶活性的變化趨勢則是隨培養時間而下降。其中, ATP處理組的酸性磷酸酶活性顯著高于其他三個處理組(<0.01)。

圖4 不同磷源對鏈狀裸甲藻磷同化酶活性的影響

注: 堿性磷酸酶活性定義: 20 °C中每個細胞每分鐘催化產生1 μmol酚定義為1個活力單位(U); 酸性磷酸酶活性定義: 20 °C中每個細胞每分鐘催化產生1 μmol 4-硝基苯酚定義為1個活力單位(U)。**<0.01

3 討論

3.1 營養鹽對鏈狀裸甲藻生長的影響

氮是浮游植物生長的必需元素, 是合成浮游植物細胞結構的必要組分。本研究中鏈狀裸甲藻在以NaNO3、NaNO2、NH4Cl、尿素為唯一氮源的培養基中均可以生長, 有明顯的指數生長期和平臺期, 并達到較高細胞密度, 表明鏈狀裸甲藻可以利用NaNO3、NaNO2、NH4Cl和尿素作為氮源, 利于其在自然環境中利用不同形態氮源維持正常的生長。當以硝態氮為唯一氮源時, 鏈狀裸甲藻的最大比生長率(m)是其他處理組m的1.5～2.0倍, 但是營養吸收動力學結果顯示半飽和常數(K)的大小順序為NaNO3>NaNO2>尿素>NH4Cl, 表明鏈狀裸甲藻對銨鹽的親和性最高(親和系數值=0.118), 該特點與其他藻種類似, 因為與尿素和硝氮相比, 銨氮被轉化為氨基酸被利用所需的途徑較少, 是消耗能量最低最“經濟”的氮源(Levasseur, 1993; Hunter, 2000; 陳建業等, 2014; Liu, 2015)。但是, 當培養基中NH4Cl濃度大于100 μmol/L時, 鏈狀裸甲藻細胞死亡; 因為, 較高濃度NH4+可轉化為NH3, 對藻細胞產生毒害作用, 類似結果在以往研究中也有報道 (Leong, 2004; 李朝霞等, 2010; Liu, 2015)。而且, 相似的毒性效應也出現在以尿素和NaNO2為唯一氮源的處理組中, 800 μmol/L處理組的比生長率均低于200 μmol/L處理組, 且藻密度在第8天后快速增長, 可能是此時培養基中的尿素或NaNO2濃度下降, 對藻細胞生長的抑制作用降低(Taylor, 2006; 滕亞娟, 2006; 鐘娜等, 2008)。本研究中鏈狀裸甲藻對NaNO3、NaNO2、尿素吸收的半飽和常數(K)均大于10 μmol/L, 同時日本海域鏈狀裸甲藻藻株對NaNO3的半飽和常數為7.60 μmol/L, 均高于很多其他赤潮物種, 表明該藻對這幾種氮營養的需求較高, 在低氮濃度的環境中不具備競爭優勢(Yamamoto, 2004; 鐘娜等, 2008; Liu, 2015)。但鏈狀裸甲藻對NH4+吸收的半飽和常數(K, 1.691 μmol/L)低于其他赤潮生物, 如紅色赤潮藻(, 3.47 μmol/L), 尖刺擬菱形藻(, 2.18 μmol/L)等, 表明該藻對銨鹽的利用優于其他藻種, 銨鹽在該藻赤潮形成過程中可能發揮重要作用(張誠等, 1997; Liu, 2015)。

磷也是浮游植物生存所需的主要元素, 是構成某些大分子物質不可缺少的組分(Xu, 2010; Lee, 2012)。本實驗結果表明, 4種磷源均可以促進鏈狀裸甲藻的生長, 證明鏈狀裸甲藻具有與其他浮游藻類類似的利用無機磷和有機磷化合物作為營養物質來源的能力(張清春等, 2005; 趙艷芳等, 2009; 陳建業等, 2014; 于倩等, 2015)。在NaH2PO4、G-6-P、β-G-P三種處理組中鏈狀裸甲藻的生長差別不明顯, 但在以ATP為唯一磷源處理組中, 鏈狀裸甲藻的最大比生長率最低, 且相同磷濃度條件下ATP處理組細胞密度始終低于其他處理組, 同時, 營養吸收動力學結果表明ATP處理組的半飽和系數最高, 說明鏈狀裸甲藻對ATP的親和性最低, 因此推測鏈狀裸甲藻利用ATP的能力弱于其他三種磷源。本實驗中鏈狀裸甲藻對磷酸鹽吸收的半飽和常數(0.743 μmol/L)低于許多藻種, 如三角褐指藻(Bohlin, 5.49 μmol/L), 并且高于韓國株系(2.65 μmol/L, Oh, 2007), 在福建海域鏈狀裸甲藻赤潮發生期間, 水體中的磷酸鹽濃度檢出至1.465 μmol/L, 推測在低濃度磷酸鹽水體中, 鏈狀裸甲藻可由于競爭力較強而導致赤潮(樊娟, 2010; 李光毅等, 2022)。

3.2 營養鹽對鏈狀裸甲藻酶活性的影響

近海水體中氮源形態多種多樣, 因此對多種形態氮源的吸收利用對于維持浮游藻類細胞正常生長極為重要。本實驗中各處理組中均檢測到低水平的硝酸還原酶活性, 說明鏈狀裸甲藻硝酸還原酶存在結構性表達(Mathew, 1981; 鐘娜等, 2008; 蒙蕊, 2018)。硝酸還原酶催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽, 是硝酸鹽同化過程中的限速步驟, 從而影響著藻類的生長(Solomonson, 1990; 唐洪杰等, 2006)。本研究中, 鏈狀裸甲藻的硝酸還原酶活性最大為2.40×10–8U/cell,遠低于其他藻種的硝酸還原酶活性, 再次說明鏈狀裸甲藻在低氮濃度環境中不具備競爭優勢(王金花等, 2008; 王燕, 2011; 丁雁雁, 2012; Liu, 2015)。與其他氮源相比, NH4+被轉化為氨基酸所需的途徑較少, 是谷氨酰胺合成酶催化反應的底物, 以NH4+為氮源會提高谷氨酰胺合成酶活性表達, 這與之前的研究類似(趙越等, 2003; Forde, 2007; Liu, 2015; 丁光茂, 2018; 蒙蕊, 2018; 江志堅等, 2023)。隨著培養時間的延長, 尿素處理組的谷氨酰胺合成酶活性顯著高于其他處理組, 這可能是與該藻對尿素的吸收過程有關。藻細胞對不同形態氮源的吸收存在主動吸收和被動吸收兩種形式: 對于無機營養鹽, 可以通過主動運輸的方式在很短時間內大量吸收后再利用; 而對于尿素的吸收過程是被動運輸, 需要胞內外的濃度差, 細胞內尿素經脲酶水解利用后濃度下降, 再吸收細胞外的尿素, 因此, 藻細胞對尿素的吸收利用是一個緩慢的過程。本研究中, 培養到第8天后, 與其他無機鹽處理組相比, 尿素處理組中仍有較高的氮濃度(圖5), 導致谷氨酰胺合成酶活性較高(Carvalho, 2004; Collos, 2005; Lindehoff, 2010)。本研究在4種氮源處理組中均檢測到脲酶活性, 意味著脲酶是鏈狀裸甲藻的一種組成酶, 可以隨時吸收利用水體中的尿素(Antia, 1991; Singh, 1991; 蒙蕊等, 2018)。但不同氮源條件下其表達活性仍有所不同, 以尿素為唯一氮源的處理組中脲酶活性顯著高于其他處理組(<0.01), 表明脲酶活性受環境中氮源的調控(Dyhrman, 2003; Fan, 2003; Liu, 2015; 黃曉云, 2015)。但不同藻種的脲酶活性受外界氮濃度的影響有所不同, 研究發現球形棕囊藻()藻細胞中脲酶活性與硝酸鹽濃度呈顯著正相關關系, 而野外亞歷山大藻()中脲酶活性隨著溶解無機氮濃度而降低, 這種差異在其他藻種中也有發現(Peers, 2000; Dyhrman, 2003; 蒙蕊, 2018), 可見氮濃度對鏈狀裸甲藻脲酶活性的影響仍需進一步地研究。

圖5 100 μmol/L濃度不同氮源處理組中氮營養鹽濃度變化

海洋中磷源多種多樣, 許多藻種都具有利用多種含磷化合物的能力。研究表明, 在無機磷缺失的環境中, 藻細胞可以通過誘導合成堿性磷酸酶分解水體中的有機磷, 或者通過酸性磷酸酶水解胞內儲存的多聚磷酸鹽, 來供藻類維持生長(黃邦欽等, 1999; Hernández, 2002; Bai, 2014)。本研究中, 培養初期, 各處理組藻細胞內可能仍有部分儲存的多聚磷酸鹽供藻類維持生長, 此時酸性磷酸酶活性處于高點; 隨著培養的進行, 胞內磷酸鹽逐漸降低, 酸性磷酸酶活性下降, 而堿性磷酸酶活性升高, 用于分解胞外可利用的有機磷。培養末期, 兩種酶的活性均降到了低值, 推測是由于胞外和胞內的磷營養都被耗盡, 這種酶活性隨培養時間的變化與之前的研究類似(Oh, 2002; 張清春等, 2005; 楊維東等, 2008; Bai, 2014; 于倩等, 2015)。其中, 無機磷處理組的堿性磷酸酶活性始終低于其他有機磷處理組, Oh等(2002)的研究結果也表明外界較高的H2PO4–濃度會抑制堿性磷酸酶活性的表達, 當外界無機營養鹽濃度降低時細胞內堿性磷酸酶活性會迅速上升, Oh等(2002)也發現外界磷酸鹽濃度降低會誘導鏈狀裸甲藻細胞內堿性磷酸酶活性上升。目前, 關于浮游植物對有機磷的利用途徑有2種猜想: 一種是可被直接吸收利用的小分子有機磷, 如G-6-P; 另一種是需經堿性磷酸酶等水解作用后才能被吸收利用的較大分子有機磷, 如蛋黃卵磷脂(Bentzen, 1991; 洪華生等, 1992; 黃邦欽等, 1999; 鄒迪等, 2005)。本研究中, G-6-P和β-G-P雖然是有機磷, 但是這兩個處理組堿性磷酸酶活性大小與無機磷處理組無顯著差異, 推測這兩種有機磷可能無需通過酶解作用而被直接吸收利用; 而在第10天時ATP處理組的堿性磷酸酶活性是其他處理組的2倍, 因此推測鏈狀裸甲藻可能并不是直接吸收ATP, 而是經由堿性磷酸酶或者5′核苷酸酶水解成為無機磷后才可被細胞吸收利用(王艷等, 2006; 楊維東等, 2008)。

4 結論

(1) 鏈狀裸甲藻在以NaNO3、NaNO2、NH4Cl、尿素為唯一氮源的水體中均可生長, 但對NH4Cl的親和性最高, 高濃度的NaNO2、NH4Cl、尿素對藻細胞有毒性效應。

(2) 鏈狀裸甲藻在以NaH2PO4、G-6-P、β-G-P和ATP為唯一磷源的水體中均可生長, 但對ATP的利用效率最低。

(3) 鏈狀裸甲藻中硝酸還原酶是結構性表達且活性較低, 導致鏈狀裸甲藻在低氮環境中不具備競爭優勢; 谷氨酰胺合成酶和脲酶的活性分別受其銨鹽、尿素底物的誘導而增高; 鏈狀裸甲藻對尿素的緩慢吸收可能導致培養后期谷氨酰胺合成酶的活性高于無機氮培養組。

(4) 鏈狀裸甲藻可通過提高堿性磷酸酶活性水解環境中的有機磷, 滿足藻細胞對磷的需求; 鏈狀裸甲藻細胞對小分子有機磷G-6-P、β-G-P的吸收利用可能并不需要堿性磷酸酶的參與, ATP為磷源時可誘導藻細胞產生較高的堿性磷酸酶活性。

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EFFECTS OF NITROGEN AND PHOSPHORUS SOURCES ON GROWTH AND ASSIMILATION ENZYMES OF DINOFLAGELLATE

SHI Jing-Yuan1, 3, LIU Yun1, 2, ZHANG Ying-Xin1, 3, ZHANG Xu-Tao1, 3, SONG Shu-Qun1, 2, LI Cai-Wen1, 2, 3, 4

(1. CAS Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Marine Ecology and Environmental Science laboratory, Laoshan Laboratory, Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

To classify the adaption mechanism ofto nitrogen and phosphorus, a batch culture ofwas carried out in different sources (species) of nitrogen and phosphorus.was able to grow well on multiple N and P substrates within appropriate ranges of concentrations. The dinoflagellate showed the greatest affinity to NH4+in the nitrogen concentration of 0～800 μmol/L, while the lowest capacity for utilizing ATP (adenosine triphosphate) in the phosphorus concentration of 0～32 μmol/L. At the early stage of the growth, the glutamine synthetase activity was the highest when grown on NH4+. Along with the growth of, both glutamine synthetase and urease were induced by urea. Additionally, the activity of nitrate reductase was extremely low, indicating its competitive weakness in the nitrate-deplete environment. In all P treatments, the alkaline phosphatase activity increased with time and then decreased, while the acid phosphatase activity (except ATP treatment) decreased. Both enzymes expressed the highest activity when grown on ATP and showed similar activity among other three P sources. Results indicate that different nitrogen and phosphorus species had significant effects on the growth of. The dinoflagellate could regulate the activity of glutamine synthetase, urease, alkaline phosphatase, and acid phosphatase to assimilate different types of nutrients. This study provided a reference for revealing the adaptation mechanism ofto different nutrients, and promoted fundamental knowledge regarding the formation mechanism ofblooms along the coast of China.

; nitrogen; phosphorus; growth; enzyme activity

* 國家自然科學基金, 41976136號;國家重點研發項目, 2022YFC3105202。史競園, 博士研究生, E-mail: shijingyuan@qdio.ac.cn

李才文, 博士生導師, 研究員, E-mail: cwli@qdio.ac.cn

2022-12-18,

2023-02-06

X55

10.11693/hyhz20221200334