長毛對蝦(Penaeus penicillatus)SNP標記開發(fā)及親子鑒定技術研究*

游淞元 楊 樂 曾慶民 張 靜 黃良敏 張東玲① 劉賢德①

長毛對蝦()SNP標記開發(fā)及親子鑒定技術研究*

游淞元1楊 樂1曾慶民2張 靜1黃良敏1張東玲1①劉賢德1①

(1. 福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室 集美大學水產(chǎn)學院 福建廈門 361021; 2. 福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室 福建省水產(chǎn)研究所 福建廈門 361013)

長毛對蝦是我國南方沿海地區(qū)的重要經(jīng)濟蝦類。近年來, 由于過度捕撈、病害頻發(fā)以及海洋環(huán)境惡化, 長毛對蝦的自然資源量大幅減少。為補充自然資源, 改善種群結構, 1980年我國開始對長毛對蝦開展增殖放流工作。然而, 增殖放流的效果如何, 目前尚缺乏有效的評估手段。以長毛對蝦為實驗材料, 通過對其基因組進行測序和重測序開發(fā)SNP (single nucleotide polymorphism)標記, 最終建立長毛對蝦的親子鑒定技術。具體研究結果如下: 長毛對蝦基因組大小為1 335.76 Mb, GC (guanine cytosine)含量為40.86%, N50為1 221 bp; 以組裝的長毛對蝦基因組為參考基因組通過重測序進行SNP挖掘, 共獲得12 579 780個原始SNP位點, 經(jīng)篩選, 優(yōu)化及模型選擇, 最終建立了基于192個SNP標記的長毛對蝦親子鑒定技術, 親子鑒定成功率為100% (95%的置信度)。研究結果可為下一步長毛對蝦增殖放流效果評估提供參考。

長毛對蝦; SNP; 親子鑒定; 增殖放流

長毛對蝦()又稱紅蝦、大蝦、明蝦等, 隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda), 甲殼綱(Crustacea), 十足目(Decapoda), 對蝦科(Penaeidae), 對蝦屬(), 屬暖水性大型蝦類, 廣泛分布于我國福建、海南、廣東和臺灣等沿海地區(qū), 是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的經(jīng)濟蝦類(王淵源, 1981; 王春忠等, 2014)。長毛對蝦具有生長速度快、存活率高、抗逆性強等特點。長毛對蝦的溫度的適應性較廣, 生存溫度為10～40 °C, 在低溫條件下, 長毛對蝦的生長速度比其它蝦種的生長速度快。自20世紀50年代長毛對蝦人工苗種技術取得突破之后, 長毛對蝦一度成為我國南方沿海越冬時的首選換季蝦種之一(張桂玲, 2009; 張桂玲等, 2010; 袁藝, 2016)。20世紀90年代, 僅福建省長毛對蝦養(yǎng)殖規(guī)模就已超過1.33萬hm2。然而近年來隨著海洋環(huán)境惡化、病害頻發(fā)以及過度捕撈等原因, 長毛對蝦資源量急劇下降(陳炎輝等, 1996; 劉勝男等, 2019)。

增殖放流是指向自然水體中投放人工繁育的苗種以增加種群數(shù)量、優(yōu)化群落結構, 是恢復漁業(yè)資源的重要手段之一(Li, 1999)。自1980年起, 我國各地區(qū)相繼開展長毛對蝦增殖放流工作(張桂玲, 2009)。福建省最早于1982年在東吾洋進行長毛對蝦的增殖放流, 放流總量超過700萬尾(關金藏, 1984)。2003～2009年, 福建省連續(xù)6年在羅源灣等海域放流長毛對蝦共計11.4億尾, 通過增殖放流不僅能使?jié)O業(yè)資源得到恢復性增長, 而且還能產(chǎn)生明顯的社會、生態(tài)、經(jīng)濟效益, 據(jù)統(tǒng)計, 羅源灣海域的長毛對蝦捕撈量平均以每年9.4%的速度快速增長, 放流效果顯著(董海, 2009; 楊爽等, 2014)。

隨著增殖放流活動持續(xù)開展以及規(guī)模不斷擴大, 如何對放流效果進行準確有效的評估也變得尤為重要(張崇良等, 2022)。目前, 標志回捕法是增殖放流效果評估的主要方法(李小芳, 2012), 傳統(tǒng)的標記主要包括物理標記和化學標記。物理標記是利用標志掛牌、剪鰭等方式對個體進行區(qū)分, 其缺點是對幼體傷害較大、標志易脫落等(王陌桑, 2016)。化學標記是對幼體注射熒光標志物等, 但化學標記具有成本較高、檢測復雜, 有可能對環(huán)境造成污染等缺陷(Phinney, 1967; Catalano, 2001)。因此, 傳統(tǒng)的標記方法難以對放流效果進行有效的評估。

系譜信息是水生動物良種選育的關鍵, 主要體現(xiàn)在群體遺傳力的計算、親子關系的鑒定以及育種方案的制定等。然而我國多數(shù)水生動物并沒有建立起一套完整、準確的系譜信息(殷彬等, 2017)。錯誤的系譜信息往往會增加近親繁殖的可能, 導致種質(zhì)資源衰退、遺傳多樣性降低, 影響良種選育的進程(朱克誠等, 2020)。因此, 開展系譜信息的相關研究具有十分重要的意義。目前, 應用較多的為微衛(wèi)星標記和SNP標記等分子標記。微衛(wèi)星標記具有基因座小、多態(tài)性高、共顯性、分辨力高等優(yōu)點而被廣泛應用在水產(chǎn)動物的系譜分析和親子鑒定研究(Chowdhury, 2021), 但基于微衛(wèi)星標記的親子鑒定方法在基因分型過程中會遇到基因分型錯誤、等位基因缺失等問題, 影響其鑒定結果(Hoffman, 2005; Tokarska, 2009)。近些年發(fā)展起來的單核苷酸多態(tài)性(SNP)是一種共顯性的雙等位基因分子標記, 具有遺傳穩(wěn)定性高、位點分布廣泛、易實現(xiàn)高通量檢測以及基因分型錯誤率低等優(yōu)點(Yue, 2014; Nguyen, 2018; Van Deventer, 2020), 是一種更準確可靠的分子標記。相比于SSR標記, SNP標記的親子鑒定效力更高, 更能夠準確有效的評估增值放流效果。目前, SNP標記正迅速取代親子鑒定研究中的微衛(wèi)星標記, 成為各種水生生物系譜追蹤的主流標記之一, 并逐步用于增殖放流效果的評估。

通過SNP標記對群體進行親子鑒定以及遺傳多樣性等分析, 能夠高效地選擇繁育材料, 對物種的良種選育、遺傳分化等研究具有重要的作用(申淑慧等, 2020)。近些年來, SNP標記在親子鑒定、遺傳多樣性分析以及育種等方面的已有較多報道。如在陸生動物中, S?lzer等(2022)基于SNP標記對荷斯坦奶牛()遺傳力進行估計, 并成功找到了兩個與牛爪病關聯(lián)的基因。余國春(2014)利用120個SNP標記成功對豬(f.)的24個樣本進行親緣關系鑒定, 鑒定結果與真實系譜關系完全一致。在水生生物中, Zhao等(2018)使用58個SNP標記在大口黑鱸()群體中進行親子鑒定, 劉峻宇等(2021)使用37個SNP標記對22個凡納濱對蝦()進行了遺傳多樣性和親子鑒定分析。然而, 目前長毛對蝦尚缺乏SNP標記, 也沒有看到基于SNP標記對長毛對蝦進行親子鑒定技術的相關報道。

為此, 本研究首先初步組裝了長毛對蝦的基因組, 接著利用長毛對蝦的基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā)出大量SNP標記, 然后對這些標記進行篩選、評估, 最終建立了基于SNP標記長毛對蝦的親子鑒定技術。研究結果可為長毛對蝦的增殖放流效果評估、遺傳多樣性分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品與DNA提取

實驗于2021年8月1日在福建省虹海水產(chǎn)開發(fā)有限公司進行。已抱卵的雌蝦由漁民在海區(qū)采捕, 運回養(yǎng)殖廠后置于一個產(chǎn)卵池中自然產(chǎn)卵。當雌蝦產(chǎn)卵后, 將卵用200目過濾網(wǎng)收集后轉(zhuǎn)入到新的水泥池進行孵化、養(yǎng)殖。待子代蝦苗養(yǎng)殖至體長1 cm以上時, 隨機取49尾仔蝦保存于80%乙醇中備用。同時, 剪取91尾親蝦的腹部肌肉組織保存于80%乙醇中, 備用。

使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根, 北京)提取91尾親蝦和49尾仔蝦的DNA。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳和酶標儀對DNA質(zhì)量和濃度進行檢測。提取的基因組DNA儲存在–20 °C備用。

1.2 長毛對蝦基因組初步組裝

選取1尾海區(qū)捕撈的長毛對蝦進行基因組測序, 獲得原始數(shù)據(jù)后, 使用Trimmomatic軟件(Bolger, 2014)對原始數(shù)據(jù)進行過濾, 清除低質(zhì)量、接頭污染以及N堿基含量過高的序列后獲得clean data。隨后, 使用SOAPdenovo2軟件(Xie, 2014)對clean data進行拼接、組裝, 獲得長毛對蝦的參考基因組。

1.3 SNP標記開發(fā)與過濾

對140尾長毛對蝦進行全基因組重測序, 通過BWA+GATK的Pipeline (McKenna, 2010)進行SNP挖掘。首先使用BWA、SAMtools (Li, 2009)以及GATK構建基因組索引, 利用BWA軟件將每個樣品序列Mapping到參考基因組上, 通過SAMtools軟件去除重復的reads并排序得到bam文件, 最后運行GATK軟件進行SNP Calling, 開發(fā)長毛對蝦的SNP標記。為了減少低質(zhì)量和假陽性位點對后續(xù)分析準確性造成干擾, 使用VCFtools軟件(Danecek, 2011)對原始SNP位點過濾, 過濾條件為: (1) 最低的質(zhì)量分數(shù)(minQ) ≥30; (2) 過濾次要等位基因深度<3的SNP; (3) 刪除缺失率>5%的SNP; (4) 僅保留二等位基因; (5) 保留次要等位基因頻率>0.05的SNP。

1.4 親子鑒定技術的建立

使用CERVUS軟件(Kalinowski, 2007)進行親子鑒定分析。CERVUS是基于最大似然法的原理來推斷親子關系。在CERVUS軟件中, LOD值(log- likelihood ratio)是進行親子關系判定的重要指標。在進行鑒定時,當LOD值為正數(shù)時表明假設親本與子代之間可能存在親子關系, 且LOD越大, 可靠性越強。實驗使用的長毛對蝦親本是來自于海區(qū)捕獲的抱卵雌蝦, 所以孵化出的長毛對蝦子代只能確定其母本, 無法確定其父本。因此, 本研究選擇單親母權親子鑒定模型對長毛對蝦進行親子關系鑒定, 對于當前的研究分析, 只有置信度達到95%以上時, 子代才會被視為正確的分配給親本。進行親子鑒定時, 模擬參數(shù)如下: 91個候選母本產(chǎn)生10 000個模擬后代, 100%的母本被抽樣, “最小分型基因座”設置為SNP總數(shù)的一半, 1%的分型錯誤率, 設置80%和95%兩個置信度。

本研究從次要等位基因頻率(MAF)、SNP數(shù)量兩個方面對親子鑒定結果進行優(yōu)化、分析。首先, 在保持SNP個數(shù)不變的情況下, 對MAF值的重要性進行分析。根據(jù)MAF的大小, 設置若干組MAF, 每組隨機挑選相同的SNP位點進行親子鑒定分析; 接著, 根據(jù)上一步的結果, 在保持MAF值相對恒定的情況下, 對SNP個數(shù)進行優(yōu)化, 形成若干組SNP組合, 進行親子鑒定分析; 然后再綜合其它參數(shù)對SNP個數(shù)進行進一步的優(yōu)化, 最終確定適合長毛對蝦親子鑒定的SNP標記個數(shù)。

2 結果

2.1 長毛對蝦基因組初步組裝

利用Platanus軟件(Pryszcz, 2016)計算組裝長毛對蝦基因組最佳值, 結果顯示當=27時, 組裝效果較好。基于=27, 利用GenomeScope軟件(Vurture, 2017)評估長毛對蝦基因組, 大小為1 445.70 Mb, 雜合度為0.65%, 重復率為71.3%。通過SOAPdenovo2 (=27)進行組裝, 組裝結果為: 長毛對蝦基因組大小為1 335.76 Mb, GC含量為40.86%, N50為1 221 bp。此次長毛對蝦基因組基于純二代測序組裝, 且基因組本身重復序列多, 雜合度高, 故N50長度比預期短。經(jīng)BUSCO評估結果顯示, 215 (21.2%)條單拷貝基因序列被覆蓋, 1 (0.1%)條多拷貝被覆蓋, 377 (37.2%)條基因序列覆蓋不完全, 412 (41.6%)條基因序列缺失, 表明基因組組裝完整性偏低, 但用于SNP標記開發(fā)已經(jīng)足夠。

2.2 長毛對蝦SNP標記開發(fā)與過濾

采用BWA+GATK的策略對140尾長毛對蝦的重測序數(shù)據(jù)進行SNP挖掘, 共獲得12 579 780個原始SNP位點。按照表1標準篩選SNP, 過濾質(zhì)量值<30、次要等位基因深度<3的SNP, 得到111 213個SNP。隨后, 刪除缺失率>5%的SNP, 剩余2 717個SNP; 最后, 僅保留雙等位基因以及保留MAF>0.05的SNP后, 共得到630個可用于親子鑒定的候選位點。

表1 SNP過濾過程

Tab.1 The SNP filtering process

注: --minQ 30、--mac 3、--max-missing 0.95、--min-alleles 2、--max-alleles 2、--maf 0.05為過濾過程中的過濾指令, “--”為連接上一參數(shù)的指令

2.3 長毛對蝦親子鑒定技術建立

2.3.1 次要等位基因頻率(MAF)的重要性評估 根據(jù)MAF的大小, 設置三組MAF, 分別為0.05～0.20、0.20～0.35和0.35～0.50 (梯度為0.15), 每組隨機挑選95個SNP位點進行親子鑒定分析, 鑒定結果如表2所示。在95%的置信度下, 三組SNP標記的親子鑒定成功率隨著MAF的增加而增加, 鑒定成功率從40.8%上升到81.6%, 說明在SNP個數(shù)保持不變的情況下, 親子鑒定成功率與MAF值呈正比。

表2 SNP個數(shù)相同時, 不同MAF范圍親子鑒定結果

Tab.2 Parentage assignment under different MAF ranges and the same number of SNP

2.3.2 SNP個數(shù)的重要性評估 根據(jù)上一步得出的結論, 當MAF在0.35～0.50之間時, 親子鑒定成功率最高。隨后在此范圍下形成六組SNP, 每組的SNP個數(shù)在50到300之間變化(梯度為50), 使用CERVUS分析50、100、150、200、250和300個SNP的遺傳信息, 結果如表3所示。總體來看, 隨著SNP個數(shù)的增加, 基因分型比例以及各項遺傳信息也隨之增加。在95%的置信度下, 使用母權親子鑒定的模型進行親子鑒定, 鑒定結果如圖1所示。當SNP個數(shù)為50時, 親子鑒定成功率最低, 僅為24.4%。但隨著SNP數(shù)量的增加, 鑒定成功率也逐漸提高。當SNP個數(shù)達到200個時, 親子鑒定成功率達到100%。隨后, 繼續(xù)增加SNP個數(shù), 親子鑒定成功率也沒有發(fā)生改變。

表3 六組SNP組合(MAF=0.35～0.50)的遺傳信息

Tab.3 Genetic information of six SNP combinations (MAF=0.35～0.50)

圖1 MAF值保持恒定下不同SNP個數(shù)的親子鑒定成功率

2.3.3 最優(yōu)SNP個數(shù)的選擇 圖1顯示, 當SNP個數(shù)為150時, 親子鑒定成功率為91.8%, SNP個數(shù)為200時, 親子鑒定成功率為100%, 因此我們在150～200個SNP的范圍內(nèi)尋找親子鑒定成功率達到100%的最少SNP個數(shù)。對200個SNP的o值按照從小到大排序, 依次刪除o最小的SNP位點進行親子鑒定分析。結果顯示, 當使用192個SNP位點時, 親子鑒定成功率達到100%。因此, 本研究192個位點為最佳SNP個數(shù)。

2.3.4 遺傳多樣性分析 利用192個SNP標記對140個長毛對蝦個體進行遺傳多樣性分析, 結果如表4顯示, 192個SNP標記在140個長毛對蝦個體中的平均觀測雜合度(o)為0.478, 平均期望雜合度(e)為0.359, 平均多態(tài)信息含量(Polymorphism information content, PIC)為0.292。

表4 長毛對蝦140個個體在192個SNP位點上的遺傳多樣性

Tab.4 Genetic diversity of 140 individuals on 192 SNPs in P. penicillatus

注: NE-1P指第一個親本的非親排除概率; NE-2P指另一親本的非親權排除概率; NE-PP指親本對非親權排除概率

3 討論

隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展, SNP標記已被逐漸應用于水產(chǎn)動物的系譜分析、親子鑒定等研究(蓋超偉等, 2021)。本研究在初步組裝長毛對蝦基因組的基礎上, 通過基因組重測序方法開發(fā)出大量的SNP標記, 經(jīng)過篩選優(yōu)化最終建立了長毛對蝦的親子鑒定技術, 為長毛對蝦增殖放流效果的評估提供了有效的技術手段。

本研究通過對140尾長毛對蝦進行全基因組測序共開發(fā)了192個可用于親子關系鑒定的SNP標記, 192個SNP位點的平均PIC含量為0.292,o平均值為0.478,e平均值為0.359, 根據(jù)Botstein等(1980)提出的多態(tài)性劃分標準, 0.25

親子鑒定的成功率受到多種因素的影響, 即MAF、基因分型錯誤率和SNPs數(shù)目(Premachandra, 2019)。次等位基因頻率(MAF)是指在特定群體中, 第二常見的等位基因出現(xiàn)的頻率。MAF值是影響親子鑒定效率的關鍵, 通常隨著MAF值的增加, 親子鑒定成功率也會隨之增加(Vu, 2021), 在許多水產(chǎn)生物中都有鑒定成功率隨MAF值增加而增加的相關報道。在鞍帶石斑魚()中, 選用高MAF值的SNP標記的非親本排除概率要高于選用低MAF值的SNP標記的非親本排除概率(Weng, 2021)。在大西洋鮭()中, 當MAF值從0.10增加到0.40時, 親子鑒定成功率從98.6%增加到100%; 在黃條鰤()中, 在保持SNP個數(shù)相同的情況下, 隨著MAF的增加, 親子鑒定成功率從87.36%提高到94.58% (Dussault, 2018; Premachandra, 2019)。在本研究中, 在保持SNP數(shù)量不變的條件下, 親子鑒定的成功率隨著MAF的增加而增加, MAF值從0.05增加到0.50, 成功率從40.8%上升到81.6%, MAF在0.35～0.50時, 鑒定成功率最高, 說明親子鑒定的成功率與MAF值呈正比, 這與上述研究結果相符。

基因分型錯誤率也是影響親子鑒定成功率的原因之一, 當基因分型錯誤率較低時(0%～10%)對鑒定的成功率影響不大, 當基因分型錯誤率較高時, 親子鑒定的成功率則會大幅降低。當有分型錯誤的個體分配到遺傳群體中, 則有可能會影響同胞個體的親緣關系鑒定(Wang, 2004)。通常情況下, 實驗室的基因分型準確率很少超過99%, 因此我們在計算機模擬過程中, 基因分型錯誤率默認為1% (Kalinowski, 2007)。

SNP數(shù)量是影響親子鑒定成功率另一重要因素。Weng等(2021)發(fā)現(xiàn), 在鞍帶石斑魚中親子鑒定率達到100%需要208個SNP位點。一般情況下, 隨著SNP數(shù)量的增加, 親子鑒定成功率也會增加, 直至保持不變。本研究中, 在保持MAF不變的情況下, 設置六組不同數(shù)量的SNP進行親子鑒定分析, 結果顯示親子鑒定成功率隨著SNP數(shù)量的增加而增加, 這也與珍珠貝() (Massault, 2021)、鯉魚() (Xu, 2017)、虹鱒() (Abadía-Cardoso, 2013)的研究結果一致。Flanagan等(2019)認為在大多數(shù)情況下, 100～500個SNP就足以解決親子關系問題, 然而在一些物種中, 使用更少的位點數(shù)就可完成親子鑒定。如Harney等(2018)使用60個信息含量最豐富的SNP標記在歐洲鮑螺()復雜家系中實現(xiàn)了95%親子鑒定成功率; 在東方牡蠣()中, Thongda等(2018)開發(fā)了58個SNP便達到了99.37%的親子鑒定成功率。在本研究中, 則需要192個SNP才能在達到95%以上鑒定成功率, 用于親子鑒定的位點數(shù)偏多, 可能與長毛對蝦基因組較大、基因組的雜合度較高有關。

總之, 親子鑒定成功率受多方面的影響, 如SNP標記的數(shù)量、質(zhì)量、基因分型準確性及群體特征等(Thongda, 2018)。因此在建立某些物種親子鑒定技術時, 不僅需要開發(fā)出具有多態(tài)性高的遺傳標記, 也要注重提高分型、分析過程的準確性, 進而確保建立的親子鑒定技術的可靠性。

4 結論

本研究以長毛對蝦為實驗材料, 通過對其進行基因組測序和重測序, 初步組裝了長毛對蝦基因組; 在此基礎上, 通過基因組重測序開發(fā)了12 579 780個SNP, 經(jīng)優(yōu)化, 最終建立了基于192個SNP標記的長毛對蝦親子鑒定技術, 鑒定成功率達到100%。該結果可為下一步長毛對蝦增殖放流效果評估、遺傳多樣性分析提供參考。

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DEVELOPMENT OF SNP MARKERS AND PARENTAGE ASSIGNMENT TECHNIQUES IN

YOU Song-Yuan1, YANG Le1, ZENG Qing-Min2, ZHANG Jing1, HUANG Liang-Min1, ZHANG Dong-Ling1, LIU Xian-De1

(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Fishery Resources and Eco-environment, Fisheries College of Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province, Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China)

is an essential marine economic shrimp in the southeastern coastal regions of China. Wild populations ofhave declined dramatically in recent years due to overfishing, marine environmental pollution, and other causes. Since 1980, China has initiated numerous stock-enhancing programs forto replenish natural resources and improve population structure. However, no efficient evaluation method is available at present. SNP (single nucleotide polymorphism) markers were developed bygenome sequencing and resequencing in, and parentage assignment techniques were established for. Results show that the genome size ofis 1 335.76 Mb, GC (guanine cytosine) content is 40.86%, and the assembly of the genome contigs N50 reaches 1 221 bp. The whole-genome sequencing and SNP marker discovery were performed using the assembledgenome as the reference genome, yielding a total of 12 579 780 original SNP markers. Through screening, optimization, and model selection, a parentage assignment technique was developed forbased on 192 SNP markers, by which a parentage assignment rate of 100% with 95% confidence was achieved. This study offered a reference for future evaluation on the stock-enhancing effects for.

; SNP; parentage assignment; enhancement and release

* 國家重點研發(fā)計劃項目, 2018YFD0901404號。游淞元, 碩士研究生, E-mail: 1042607980@qq.com

劉賢德, 碩士生導師, 教授, E-mail: xdliu@jmu.edu.cn; 張東玲, 碩士生導師, 副教授, E-mail: 342312933@qq.com

2022-11-01,

2023-02-10

Q953; Q789; S968.2

10.11693/hyhz20221100287