小黃魚(Larimichthys polyactis)鰤魚諾卡氏菌的分離及鑒定*

吳 迪 阮澤超 王躍斌 張鼎元 張 燕 許文軍 柴學軍

小黃魚(Larimichthys polyactis)鰤魚諾卡氏菌的分離及鑒定*

吳 迪1, 2阮澤超2王躍斌2張鼎元2張 燕2許文軍2柴學軍2①

(1. 浙江海洋大學水產(chǎn)學院 浙江舟山 316022; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室 浙江舟山 316021)

為探明舟山海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖小黃魚()暴發(fā)的以體表潰瘍、眼球潰爛、內(nèi)臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)為主要癥狀的疾病病因, 對患病小黃魚體表潰瘍處和結(jié)節(jié)病灶處采集組織樣本, 在血瓊脂平板上劃線培養(yǎng), 通過分離、純化到同一優(yōu)勢菌株ZHNK2101。經(jīng)形態(tài)學觀察、生理生化鑒定、16S rRNA基因片段擴增及序列比對, 確定該菌株為鰤魚諾卡氏菌()。藥敏試驗結(jié)果顯示, 菌株ZHNK2101對哌拉西林、頭孢曲松、丁胺卡那、慶大霉素等16種抗生素敏感。回歸感染試驗表明, 該菌株可以感染小黃魚并引起和自然感染相同的癥狀, 半致死濃度LD50為7.28×104CFU/尾。另外, 該病株會引起小黃魚鰓、肝、腎和脾臟發(fā)生病理變化, 主要表現(xiàn)為鰓絲紊亂, 肝臟、腎臟、脾臟組織細胞纖維化形成病理性結(jié)節(jié)。試驗首次報道了小黃魚感染鰤魚諾卡氏菌的病例, 并從理化特性、藥敏試驗、回歸感染及組織病理變化等方面對該菌株的特性進行了初步研究, 為小黃魚養(yǎng)殖過程中由鰤魚諾卡氏菌引起的內(nèi)臟白點病的早期預防和治療提供基礎數(shù)據(jù)。

小黃魚(); 鰤魚諾卡氏菌(); 藥敏試驗; 回歸感染; 組織學病理

內(nèi)臟白點病, 也稱內(nèi)臟結(jié)節(jié)病, 主要癥狀為肝、脾及腎臟出現(xiàn)大量白色肉芽腫, 近年來已經(jīng)成為魚類常見疾病之一(Chen, 2000), 在大口黑鱸() (呂麗麗等, 2021)、大黃魚() (Wang, 2005)、烏鱧(s) (王二龍等, 2015)等魚類養(yǎng)殖過程中均有報道。該病潛伏期長、發(fā)病慢, 前期癥狀主要在內(nèi)臟, 不易被察覺, 且無特效治療藥物, 往往因治療不及時導致病魚大規(guī)模死亡, 對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。

引起內(nèi)臟白點病的致病菌主要有假單胞菌(sp.) (陳卓等, 2018)、愛德華氏菌(sp.) (劉春等, 2013)和諾卡氏菌(sp.) (Chen, 2018)等。其中, 諾卡氏菌屬于放線菌目(Actinomycetales)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、諾卡氏菌屬(), 兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性菌, 為人畜共患菌, 會引起組織化膿、壞死(Wang, 2014)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 鰤魚諾卡氏菌()是造成魚類感染的諾卡氏菌病的主要病原(多甜等, 2017), 在烏鱧(王二龍等, 2015)、大口黑鱸(呂麗麗等, 2021)等養(yǎng)殖品種較為常見, 主要通過表皮傷口或者鰓進入魚體, 在肝、脾、腎等器官引起免疫應答產(chǎn)生白色結(jié)節(jié)(王文基等, 2019)。

小黃魚屬鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(), 是一種養(yǎng)殖潛力巨大的經(jīng)濟魚類。2021年9月, 在舟山市登步島附近網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地小黃魚陸續(xù)發(fā)病, 主要表現(xiàn)為離群、反應遲鈍、活力下降, 病魚體表出現(xiàn)潰瘍、部分眼睛潰爛失明、內(nèi)臟器官肝臟、脾臟腫大且有肉眼可見白色結(jié)節(jié), 其中脾臟內(nèi)白色結(jié)節(jié)較為集中, 死亡率高達50%以上, 根據(jù)癥狀可以出初步斷定是由細菌引起的內(nèi)臟白點病。因此, 本研究對患病小黃魚病原菌進行分離鑒定, 通過形態(tài)學、分子特征鑒定、生理生化特性、藥敏性及回歸感染試驗對分離菌的生物學特性進行分析, 旨在查明引起小黃魚內(nèi)臟白點病的病因, 為小黃魚養(yǎng)殖過程中應對內(nèi)臟白點病的早期預防和治療提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

小黃魚病魚樣本采集于舟山市普陀區(qū)登步島附近海水網(wǎng)箱內(nèi), 平均體長(13.44±1.25) cm, 體重(36.77± 11.28) g, 主要用于病原菌的分離純化實驗。患病小黃魚的主要癥狀表現(xiàn)為眼球紅腫、糜爛, 體表潰瘍, 鰓、腎臟、肝臟和脾臟等部位出現(xiàn)大量白色結(jié)節(jié)。

健康小黃魚樣本采集于浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗場內(nèi), 挑選皮膚完整、活力好的個體(=105)用于后續(xù)感染實驗, 平均體長(12.50±1.56) cm, 體重(35.08± 10.30) g。實驗前隨機挑選10尾健康小黃魚進行細菌、病毒和寄生蟲檢測, 確保無病原微生物攜帶。

1.2 病原菌分離純化

挑選患病嚴重的小黃魚, 于無菌環(huán)境解剖, 用接種環(huán)在眼球、鰓、腎臟、肝臟和脾臟病灶白色結(jié)節(jié)取樣, 在血瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)上劃線后培養(yǎng)于隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi), 28 °C恒溫培養(yǎng)5 d后從優(yōu)勢菌群中挑取單菌落進一步純化培養(yǎng)3代, 將分離純化的菌株編號為ZHNK2101。

1.3 分離菌形態(tài)學觀察

將分離純化后的細菌接種于血瓊脂培養(yǎng)基, 28 °C恒溫培養(yǎng)5 d后挑取單菌落觀察菌落形態(tài), 同時對純化細菌進行革蘭氏染色和觀察。

1.4 分離菌的分子特征鑒定

使用細菌基因組提取試劑盒(TaKaRa公司)提取純化細菌的全基因組DNA作為擴增模板, 利用PCR SuperMix (北京全式金公司) DNA聚合酶和細菌16S rRNA通用引物(上游引物5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′、下游引物5′-TACGACTTAACCCCAAT CGC-3′), 完成目標片段PCR擴增, 引物由上海生工公司合成。PCR循環(huán)參數(shù): 94 °C 3 min; 94 °C 10 s, 54 °C 5 s, 72 °C 10 s, 30個循環(huán); 72 °C, 5 min。預計目標片段約1 400 bp, 經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收PCR產(chǎn)物, 送至上海華大基因有限公司進行測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN分析后與GenBank上已公布的基因序列進行比較, 采用MEGA 11及EVOLVIEW軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.5 分離菌的理化特征鑒定及藥物敏感性試驗

根據(jù)《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等, 2001)方法, 以鰤魚諾卡氏菌菌株JCM3360為參考, 將分離菌ZHNK2101接種于細菌微量生化鑒定管(杭州微生物試劑有限公司)中, 主要對碳源利用、酶活性及水解活性等理化指標進行檢測分析。

藥物敏感性測定采用紙片瓊脂擴散法, 將培養(yǎng)的細菌用PBS調(diào)整至1.0×108CFU/mL, 取100 μL均勻地涂布于血瓊脂培養(yǎng)基, 10 min后貼上不同的藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司), 28 °C恒溫培養(yǎng)3 d后測量抑菌圈直徑。

1.6 回歸感染實驗

將健康的小黃魚暫養(yǎng)于700 L養(yǎng)殖桶內(nèi), 水溫(25±1) °C, 連續(xù)充氣, 日換水量100%, 每日投餌2次,馴化一周, 實驗前隨機挑選總數(shù)10%的小黃魚進行病原檢測, 無病原檢出方可用于回歸感染實驗。將分離的菌株接種于BHI培養(yǎng)基, 28 °C恒溫、200 r/min培養(yǎng)7 d后離心收集細菌。健康小黃魚隨機分為4組(3個感染組, 1個對照組), 每組20尾, 利用PBS緩沖液將菌液濃度調(diào)整為1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/mL三個濃度, 感染組每尾腹腔注射300 μL菌液,對照注射相同體積PBS緩沖液。實驗期間水溫控制在(25±1) °C, 正常投喂、換水, 連續(xù)觀察21 d, 每天記錄小黃魚發(fā)病狀況, 用MS-222 (Sigma-Aldrich公司)麻醉瀕死的小黃魚后進行剖檢及病原菌分離, 收集瀕死的小黃魚肝臟、脾臟、腎臟等器官用Bouin’s液固定, 經(jīng)石蠟包埋切片、H.E染色及中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察各組織病理變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病小黃魚剖檢觀察

患病小黃魚體表鱗片脫落, 出現(xiàn)多處潰瘍并伴隨著出血, 眼球紅腫、糜爛(圖1a, 1b)。剖檢發(fā)現(xiàn)腹中有大量黃綠色腹水, 肝臟開始腫大, 鰓、脾臟、肝臟、脾臟等器官表面出現(xiàn)不同數(shù)量的白色結(jié)節(jié)(圖1c, 1d, 1e), 其中脾臟表面白色結(jié)節(jié)分布最為密集(圖1f)。

注. a. 患病魚體表出現(xiàn)潰瘍, 鱗片脫落; b. 患病魚體表潰瘍處伴有出血, 眼球紅腫、糜爛; c. 患病魚鰓出現(xiàn)少量白色結(jié)節(jié); d. 患病魚肝臟水腫、糜爛且出現(xiàn)白色或淡黃色結(jié)節(jié); e. 患病魚腎臟出現(xiàn)少量白色結(jié)節(jié); f. 患病魚脾臟出現(xiàn)大量1～2 mm且質(zhì)地偏硬白色結(jié)節(jié)

2.2 病原菌分離與形態(tài)學觀察

取脾臟、肝臟等結(jié)節(jié)病灶組織接種于血瓊脂培養(yǎng)基,經(jīng)分離和純化后得到一優(yōu)勢菌株ZHNK2101。分離得到的病原菌生長緩慢, 在血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后出現(xiàn)少數(shù)菌落, 菌落呈白色或淡黃色, 形狀為不規(guī)則的雪花狀、不透明、干燥、粗糙, 表面有菌膜覆蓋(圖2a)。在100倍鏡下觀察菌體呈桿絲狀, 革蘭氏染色后該菌呈藍色, 故初步判斷為革蘭氏陽性菌(圖2b)。

圖2 ZHNK2101生長菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果

注: a. 血瓊脂培養(yǎng)基上白色菌落; b. 菌株革蘭氏染色呈陽性(藍紫色)

2.3 分離菌株的理化特征

生理生化試驗結(jié)果顯示, 分離菌株ZHNK2101能以D-葡萄糖和檸檬酸鹽作為唯一碳源生長, 無法利用阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇。酶活性方面, 分離菌過氧化氫酶呈陽性, 氧化酶、脲酶和溶菌酶呈陰性, 無法還原硝酸鹽。此外, 該菌能夠水解七葉苷, 不能水解明膠、淀粉、酪素、黃嘌呤和酪氨酸, 無法在35 °C及以上環(huán)境生長。分離菌理化性質(zhì)同參考菌株鰤魚諾卡氏菌JCM3360基本相同, 符合諾卡氏菌屬的基本特征(表1)。

表1 分離菌生理生化特征

Tab.1 Physiological and biological characteristics of isolated bacteria

注: “+”表示陽性反應, “–”表示陰性反應

2.4 分離菌株的分子特征鑒定

分離菌株ZHNK2101的16S rRNA基因擴增結(jié)果如圖3所示, 在1 500 bp處出現(xiàn)單一明顯條帶, 測序結(jié)果顯示該DNA片段長度為1 365 bp (GenBank登錄號為OP741014)。此外, 從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取11條諾卡氏菌屬的參考菌株16S rRNA基因序列, 利用MEGA11和ClastalX軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4), 結(jié)果顯示分離菌株ZHNK2101和(MT052585和AF380938)聚為一支, 序列相似度為100%。結(jié)合菌落形態(tài)、理化特性和分子特征結(jié)果, 可以確定分離菌株ZHNK2101為鰤魚諾卡氏菌。

圖3 菌株ZHNK2101的16S rRNA擴增結(jié)果

注: M: DL 2000 DNA Marker; 1: 陰性對照; 2: ZHNK2101 (約1 400 bp)

圖4 菌株 ZHNK2101和其他諾卡病株 16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 分離菌株ZHNK2101藥敏實驗結(jié)果

對分離菌株ZHNK2101進行29種抗生素藥敏實驗, 結(jié)果顯示, 該菌株對哌拉西林、頭孢曲松、丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、紅霉素、麥迪霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、復方新諾明和氯霉素16種抗生素敏感, 對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢哌酮、萬古霉素、呋喃唑酮和克林霉素表現(xiàn)耐受(表2)。

表2 分離菌藥敏實驗結(jié)果

Tab.2 Results of the susceptibility test of isolated bacteria

注: R表示耐藥; S表示敏感

2.6 回歸感染實驗

以腹腔注射的方式將分離菌株ZHNK2101注射至小黃魚體內(nèi), 結(jié)果顯示對照組小黃魚未出現(xiàn)任何癥狀, 死亡率為0; 在各實驗組中小黃魚均出現(xiàn)了發(fā)病和死亡情況且死亡率均為100%, 但是不同濃度組發(fā)病死亡情況有所不同。其中, 1.0×108CFU/mL組小黃魚感染3 d開始出現(xiàn)了死亡個體, 9 d全部死亡; 1.0×107CFU/mL組小黃魚感染4 d開始出現(xiàn)死亡個體, 16 d全部死亡; 1.0×106CFU/mL組小黃魚發(fā)病持續(xù)時間較長, 感染7 d開始出現(xiàn)死亡個體, 19 d全部死亡(圖5)。對各個實驗組死亡小黃魚數(shù)量進行統(tǒng)計分析, 利用寇氏法計算得到該菌株對小黃魚7d的LD50為7.28×104CFU/尾, 即LD50為2.19×102CFU/g。回歸感染實驗中發(fā)病小黃魚感染前期(第1 d至第7 d)體表無明顯癥狀, 但是脾臟、腎臟和肝臟陸續(xù)出現(xiàn)細小的白色結(jié)節(jié), 其中脾臟表面白色結(jié)節(jié)出現(xiàn)時間最早、數(shù)量最多。到感染后期(第10 d以后), 發(fā)病小黃魚體表開始出現(xiàn)潰瘍, 眼體發(fā)生紅腫糜爛, 內(nèi)臟白色結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多, 癥狀與之前自然病例相似。另外, 從感染死亡的小黃魚病灶處分離出的病原菌, 對其菌落形態(tài)及革蘭氏染色觀察, 與自然發(fā)病分離的病原菌一致, 表明所分離病株ZHNK2101為此次患病小黃魚的致病菌。

圖 5 小黃魚感染鰤魚諾卡氏菌后的累計存活率

2.7 感染小黃魚組織病理變化

對回歸感染實驗中瀕死的小黃魚多個組織進行病理切片觀察, 結(jié)果顯示患病小黃魚的鰓、肝臟、脾臟和腎臟都出現(xiàn)了不同程度的病變, 具體表現(xiàn)為: 發(fā)病小黃魚鰓絲排列整齊(圖6a), 而患病小黃魚鰓絲排列紊亂, 呈現(xiàn)凋萎不整的彎曲, 鰓絲末端有紅細胞增生, 鰓小片上的呼吸上皮細胞開始出現(xiàn)不同程度的脫落(圖6b); 健康小黃魚肝胰腺組織中細胞排列規(guī)則均勻, 細胞邊緣清晰(圖6c), 而患病小黃魚肝臟細胞出現(xiàn)不同程度的形變, 細胞界限變得模糊, 有空泡出現(xiàn), 胰腺處有纖維細胞包裹住的明顯結(jié)節(jié)且結(jié)節(jié)中心有典型的病灶, 經(jīng)H.E染色為紅色, 結(jié)節(jié)周圍伴有紅細胞浸潤(圖6d); 健康小黃魚脾臟細胞形態(tài)均勻, 主要有淋巴細胞和紅細胞組成(圖6e), 而患病小黃魚脾臟組織中出現(xiàn)大量結(jié)節(jié), 結(jié)節(jié)邊界清晰且伴有細胞纖維化出現(xiàn), 結(jié)節(jié)內(nèi)部細胞出現(xiàn)不同程度的損傷, 結(jié)節(jié)中心病灶呈紅色, 結(jié)節(jié)周圍細胞壞死嚴重, 鐵黃素大量沉積(圖6f); 健康小黃魚腎臟中腎小管上皮細胞排列整齊緊密, 管腔通暢(圖6g), 而患病小黃魚腎臟腎小管上皮細胞明顯減少且分布散亂, 甚至出現(xiàn)壞死脫落, 并有與脾臟、肝臟組織相同的結(jié)節(jié)(圖6h)。

圖6 小黃魚感染鰤魚諾卡氏菌后的組織病理學變化

注: a. 健康魚鰓; b. 患病魚鰓絲紊亂, 鰓小片脫落, 鰓絲末端有紅細胞增生(箭頭所示)。c. 健康魚肝臟; d. 患病魚肝臟細胞空泡化、出血, 胰腺可見有明顯結(jié)節(jié)(箭頭所示), 結(jié)節(jié)周圍有大量纖維細胞。e. 健康魚脾臟; f. 患病魚脾臟有明顯結(jié)節(jié), 結(jié)節(jié)附近鐵黃素大量沉積(箭頭所示)。g. 健康魚腎臟; h腎小管上皮細胞脫落、壞死, 結(jié)節(jié)明顯(箭頭所示)

3 討論

諾卡氏菌是一種革蘭氏陽性菌, 需氧腐生, 廣泛存在于土壤和水中, 是人和動物的機會致病菌(張媛等, 2012)。在水產(chǎn)動物中, 能夠引起疾病的主要是鰤魚諾卡氏菌、殺鮭諾卡氏菌()、星狀諾卡氏菌()和粗形諾卡氏菌() (滿其蒙等, 2013)。其中, 鰤魚諾卡氏菌是引起魚類內(nèi)臟白點病主要致病菌, 最早分離于五條鰤() (袁思平等, 2006)體內(nèi), 可以感染包括大黃魚(Wang, 2005)、花鱸() (Chen, 2000)、牙鲆() (Kudo, 1988)等多種養(yǎng)殖經(jīng)濟性魚類。本研究從患內(nèi)臟白點病的小黃魚病灶中分離、純化到菌株ZHNK2101, 根據(jù)菌落形態(tài)、理化特征及16S rRNA基因片段序列比對, 可鑒定為鰤魚諾卡氏菌, 并進行了藥敏試驗和回歸感染試驗, 確定了該菌株是引起本次小黃魚發(fā)病的病原菌, 這也是首例鰤魚諾卡氏菌感染小黃魚引起內(nèi)臟白點病并出現(xiàn)死亡的報道。

諾卡氏菌生長緩慢, 在BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d才有少數(shù)菌落出現(xiàn), 菌落呈白色或淡黃色, 邊緣不規(guī)則, 成沙粒狀, 隨著培養(yǎng)時間的延長會出現(xiàn)較大的褶皺。在液體培養(yǎng)基中, 諾卡氏菌呈現(xiàn)絮狀沉淀, 會形成菌膜浮于液面之上(滕建等, 2022)。本研究選取了血瓊脂培養(yǎng)基來培養(yǎng)鰤魚諾卡氏菌ZHNK2101, 發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)速度明顯快于LB (基本不生長)、TSB (10 d)、BHI (7 d)培養(yǎng)基, 3 d出現(xiàn)菌落, 這可能與鰤魚諾卡氏菌容易在血液中傳播的特點有關(guān)(Wang, 2017)。另外, 該菌株能夠以D-葡萄糖和檸檬酸鹽作為唯一碳源生長, 無法利用阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇, 與其他諾卡氏菌的理化特性相似(羅愿等, 2021), 對后續(xù)培養(yǎng)基配方優(yōu)化過程中碳源選擇具有一定的參考意義。該菌株形成的菌落呈不規(guī)則、不透明的雪花狀, 表面干燥且粗糙, 菌落形態(tài)學上與之前報道的鰤諾卡氏菌菌落相似(呂麗麗等, 2021; 滕建等, 2022)。

本研究發(fā)現(xiàn)鰤魚諾卡氏菌菌株ZHNK2101回歸感染小黃魚的發(fā)病癥狀為魚體表面有潰瘍、鰓絲發(fā)白、眼睛潰爛失明, 內(nèi)臟器官表面多見白色結(jié)節(jié)狀肉芽腫, 尤其在脾臟數(shù)量最多, 結(jié)節(jié)質(zhì)地偏硬, 直徑約為1～2 mm, 這與鰤魚諾卡氏菌感染烏鱧(王二龍等, 2015)、大口黑鱸(呂麗麗等, 2021)等癥狀相似。鰤魚諾卡氏菌菌株ZHNK2101引起的白色結(jié)節(jié)和其他細菌有著較為明顯的差異, 變形假單胞菌()感染大黃魚引起的結(jié)節(jié)更為細小, 直徑約為0.4～1 mm, 主要出現(xiàn)在腎臟和脾臟(Liu, 2018); 舒氏氣單胞菌()引起的結(jié)節(jié)質(zhì)地偏軟且結(jié)節(jié)間邊緣模糊(徐春霞, 2021), 殺魚愛德華氏菌()感染大口黑鱸引起結(jié)節(jié)相互連接且形狀不規(guī)則(Fogelson, 2016), 和本研究分離的病株生產(chǎn)邊緣清晰的結(jié)節(jié)有著較大的區(qū)別, 可以作為不同類型內(nèi)臟白點病的區(qū)分依據(jù)。本研究中菌株ZHNK2101對小黃魚7 d的LD50為7.28×104CFU/尾, 明顯低于菌株NI對大口黑鱸(呂麗麗等, 2021)、ZJ0503對斑馬魚() (夏立群等, 2016)的LD50(分別為2.58×106、3.39×106CFU/尾)。這種差異可能是不同分離株之間致病性、不同種魚類抗病能力以及實驗條件的不同而導致的。

通過對產(chǎn)生結(jié)節(jié)的器官進行了病理切片觀察發(fā)現(xiàn), 患病小黃魚內(nèi)臟病理變化主要出現(xiàn)在鰓、肝臟、腎臟和脾臟, 具體表現(xiàn)為鰓絲排列紊亂、鰓絲末端細胞出現(xiàn)增生和纖維化且開始出現(xiàn)脫落, 肝臟細胞出現(xiàn)變形、細胞界限變得模糊且伴隨有空泡出現(xiàn), 腎小管上皮細胞明顯減少且分布散亂, 脾臟中出現(xiàn)細胞纖維化形成大量結(jié)節(jié)。有研究表明諾卡氏菌可通過呼吸、消化道以及體表創(chuàng)傷感染魚類(王文基等, 2019), 鰓作為最重要的呼吸器官, 是氣體交換的主要場所, 可能存在較高的感染風險。此外, 諾卡氏菌會被白細胞吞噬并在其體內(nèi)增殖, 通過血液傳播并定植于各個器官, 進而導致白細胞聚集、死亡和肉芽腫的形成(Wang, 2017), 而肝臟、脾臟和腎臟作為造血和血液循環(huán)密切相關(guān)的器官, 因此極易成為發(fā)病最為集中的部位。針對該特點, 以白細胞作為靶標可為治療諾卡氏菌引起的內(nèi)臟白點病的藥物和疫苗研究提供了新思路。另外, 結(jié)節(jié)形成本質(zhì)是一種免疫反應, 在外源病原體入侵時, 機體通過識別和包裹病原體形成結(jié)節(jié), 后續(xù)利用巨噬細胞吞噬病原體或者誘導各種免疫蛋白的分泌等途徑完成免疫應答(Kim, 2021)。

與其他來源的諾卡氏菌相似, 本研究分離的菌株對氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類等廣譜類抗生素表現(xiàn)敏感, 對大部分青霉素類、頭孢菌素類以及萬古霉素、呋喃唑酮和克林霉素等抗生素表現(xiàn)一定程度的耐藥性。目前, 在魚類養(yǎng)殖中對于諾卡氏菌的防治主要依靠抗生素, 諸如氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素等(孟思妤等, 2017; 王友娟等, 2021), 但是治療效果均不明顯, 和耐藥性試驗結(jié)果存在差異。這種耐藥性差異的產(chǎn)生和養(yǎng)殖地區(qū)和抗生素種類等因素密切相關(guān)(雷寧等, 2022), 不同菌株在分裂繁殖及針對藥物不斷選擇的過程中, 已對大部分抗生素產(chǎn)生了耐藥性(李忠琴等, 2017)。此外, 耐藥性實驗中細菌和抗生素發(fā)生了有效接觸, 抗生素能夠直接作用于細菌而抑制其繁殖生長。而在養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 鰤魚諾卡氏菌往往以胞內(nèi)寄生的形式存在魚的各個器官組織中(劉文文等, 2022), 而藥物通過浸泡、內(nèi)服等形式進入體內(nèi)無法直接作用于細菌, 同時白色結(jié)節(jié)處的細胞發(fā)生纖維化, 可能對抗生素等藥物也產(chǎn)生了一定的阻擋作用。另外, 由于生產(chǎn)過程中抗生素濫用往往也會導致細菌耐藥性增強, 導致常規(guī)的單一用藥治療方案收效欠佳。結(jié)合鰤魚諾卡氏菌引起的內(nèi)臟白點病在魚體內(nèi)潛伏期長, 前期癥狀主要集中肝臟、脾臟以及腎臟等器官的特點, 待到體表出現(xiàn)潰瘍、糜爛時已經(jīng)為感染后期, 使用抗生素無法有效降低小黃魚的死亡率。因此, 在小黃魚養(yǎng)殖過程中應該做好前期預防工作, 發(fā)現(xiàn)小黃魚行動遲緩、食欲下降應該立即進行剖檢, 在感染前期及時使用藥物進行治療。此外, 在藥物的選擇上盡量根據(jù)鰤魚諾卡氏菌隨著血液傳播的特點, 選擇能夠通過血液轉(zhuǎn)運至各組織器官的藥物。

4 結(jié)論

本研究從患內(nèi)臟白點病的小黃魚體內(nèi)分離到一病株ZHNK2101, 經(jīng)形態(tài)學觀察、生理生化分析和16S rRNA基因片段序列比對鑒定為鰤魚諾卡氏菌。回歸感染試驗顯示該病株會引起小黃魚鰓、肝、腎和脾臟發(fā)生病理變化, 并確定其對小黃魚的半致死濃度(LD50)為7.28×104CFU/尾。藥敏試驗顯示對哌拉西林、頭孢曲松等16種抗生素敏感, 為小黃魚養(yǎng)殖過程中應對內(nèi)臟白點病的早期預防和治療提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OFIN

WU Di1, 2, RUAN Ze-Chao2, WANG Yue-Bin2, ZHANG Ding-Yuan2, ZHANG Yan2, XU Wen-Jun2, CHAI Xue-Jun2

(1. Fisheries College of Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Zhejiang Key Laboratory of Marine Aquaculture, Zhejiang Institute of Marine Fisheries, Zhoushan 316021, China)

To obtain the pathogen causing symptoms of body surface ulceration, eyeball ulceration, and visceral white nodules in cage cultured small yellow croakersin Zhoushan, Zhejiang, a dominant strain named ZHNK2101 was isolated from the body surface ulcerations and nodule lesions in different tissues of infectedby plate streaking cultivation on blood agar culture medium. The isolated strain was identified asby morphological observation, physiological and biochemical identification, amplification of 16S rRNA gene fragment, and sequence alignment. Our drug sensitivity test showed that strain was sensitive to 16 antibiotics including piperacillin, ceftriaxone sodium, amikacin, gentamicin etc. The results of regression infection test showed that the strain could infect healthyand cause the same symptoms as natural infection. The half-lethal dose (LD50) of the strain towas 7.28×104CFU/fish. The strain could cause pathological changes in gill, liver, kidney, and spleen of. The main symptoms included gill filament disorder and nodules formed by cellular fibrosis in liver, kidney, and spleen tissues. We proved for the firsttime thatcould infectvia drug sensitivity test, regression infection, and histological study. This research provided basic data and theoretical support for the prevention and treatment of white-spot disease caused byin.

;; drug sensitivity; recurrent infection; histopathology

* 浙江省重點研發(fā)項目, 2020C02015號; 舟山市公益類科技項目, 2022C31055號; 浙江省海洋水產(chǎn)研究所科技計劃項目, HYS-ZY-202103號。吳 迪, 碩士研究生, E-mail: 375104254@qq.com

柴學軍, 教授級高級工程師, E-mail: chaixj6530@sohu.com

2022-11-24,

2023-02-01

S942; Q955; S917.1

10.11693/hyhz20221100306