嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起斑馬魚腸道生理損傷和腸道菌群失調*

孫 雯 王永杰① 鮑俊杰 張 靜 陳紅蓮 熊英琪

嗜水氣單胞菌()引起斑馬魚腸道生理損傷和腸道菌群失調*

孫 雯1, 2王永杰1, 2①鮑俊杰1, 2張 靜1, 2陳紅蓮1, 2熊英琪1, 2

(1. 安徽省農業科學院水產研究所 安徽合肥 230031; 2. 水產增養殖安徽省重點實驗室 安徽合肥 230031)

研究分析了嗜水氣單胞菌()感染斑馬魚后腸道生理健康和腸道微生物的變化。以斑馬魚為研究對象, 刮傷皮下真皮, 使用105CFU/mL濃度的嗜水氣單胞菌暴露6 h后轉入清水, 分別在暴露前、暴露后6 h、12 h、24 h取樣。使用魚特異性酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒, 檢測腸道中緊密連接蛋白ZO-2 (TJP2)含量和乙氧基異戊二烯-O-脫乙基酶(EROD)酶活性, 結果表明, 嗜水氣單胞菌暴露引起了斑馬魚腸道生理損傷, 表現為腸道TJP2含量、EROD酶活性在暴露后顯著下調。采用16S rRNA高通量測序檢測腸道微生物及其菌群結構變化, 嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚后致病菌不動桿菌屬()明顯增加, OTUs數量明顯下降, Alpha多樣性降低, 結果說明嗜水氣單胞菌引起了斑馬魚腸道菌群失調。腸道中微生物的多樣性與改善腸道上皮和黏膜屏障功能緊密相關, 該研究對從腸道健康的角度評價嗜水氣單胞菌毒性, 探索嗜水氣單胞菌的致病機制具有重要意義。

嗜水氣單胞菌; 斑馬魚; 腸道微生物; Alpha多樣性; TJP2

嗜水氣單胞菌()在自然界中分布廣泛, 是一種典型的人魚共患病的條件致病菌, 感染致病性嗜水氣單胞菌可導致人腹瀉、食物中毒和繼發感染(楊守明等, 2006)。嗜水氣單胞菌感染魚類種類眾多, 可以引起羅非魚()、鯰魚()、鯉魚()等魚類細菌性敗血癥, 其致死率高、流行廣, 嚴重制約了中國水產養殖業的發展(Jones,1995; Da Silva, 2012; Prayitno, 2021; Chen, 2022)。因此, 研究嗜水氣單胞菌對魚類的致病性特征及其可能的致病機理, 對漁業生產具有重要意義。

氣單胞菌的致病性與環境的變化(溫度變化、含氧量降低、氨氮升高)有關(白曉倩, 2016; 孟令杰, 2017; 孫元琛等, 2022)。目前有研究表明, 氣單胞菌感染的同時往往存在混合感染的情況(聶慧慧, 2016), 腸道微生物存在的共生菌通過競爭營養物質和腸黏膜的附著點即生態位來抑制病原菌的生長增殖(查繼偉, 2019)。有研究表明, 芽孢桿菌益生菌添加在飼料中, 能夠增加中華絨螯蟹對嗜水氣單胞菌致病菌的抵抗力(陳文典, 2009), 氣單胞菌與其他細菌存在相互作用, 而它的致病性可能依賴于腸道菌群的組成(查繼偉, 2019)。

腸道是機體一種重要的免疫器官, 其中, 腸道微生物與腸道黏膜間的交流和免疫系統密切相關(徐紹剛等, 2019), 但目前人們對腸道微生物與腸道黏膜屏障的調控機制研究仍在初級階段。穩定的腸道微生物區系影響著宿主的多種功能, 在宿主的生長發育、營養、食物消化、免疫反應以及抵抗病原菌等方面發揮了重要作用(郭軍等, 2019; 盛鵬程等, 2020)。研究嗜水氣單胞菌對魚類腸道黏膜屏障及腸道微生物的影響, 對評價嗜水氣單胞菌毒性, 以及從腸道健康的角度, 探索嗜水氣單胞菌的致病機制具有重要意義。

斑馬魚因其體型小、生長快、完備的遺傳系統和基因組資源, 已成為脊椎動物發育和人類疾病的重要模型(Neely, 2002)。本研究使用嗜水氣單胞菌暴露成年斑馬魚后, 采用ELISA和16S rRNA高通量測序, 檢測斑馬魚腸道生理指標及腸道微生物的變化, 評價嗜水氣單胞菌對腸道健康的影響, 探索嗜水氣單胞菌可能的毒性機制。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌(J5L09)來源于合肥養殖基地的患細菌性敗血癥異育銀鯽()體內分離并保存于實驗室。實驗所用的4月齡成年斑馬魚(, AB株), 從中國科學院水生生物研究所的斑馬魚育種中心(武漢, 中國)購買, 在安徽省農業科學院水產研究所進行室內循環水養殖實驗。

1.2 養殖及暴露實驗

成年斑馬魚的養殖依據Yu等(2010)提出的養殖方案進行。養殖過程中保持水溫在(28±0.5) °C, 光暗周期為14 h : 10 h, 每日喂食豐年蟲兩次。4月齡成年斑馬魚暫養14 d無死亡后開始暴露實驗。麻醉后, 用無菌手術刀沿胸鰭后方側面刮除幾片鱗片, 并刮傷皮下真皮。麻醉恢復后用(105CFU/mL)嗜水氣單胞菌浸泡6 h后轉入清水中, 分別在暴露前和暴露后6 h、12 h、24 h時進行取樣。

1.3 腸道采集

取樣前需禁食24 h, 用0.03%的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)對斑馬魚進行麻醉, MS-222是一種經過美國食品與藥物管理局(FDA)認可的漁用麻醉劑, 且對人體和水產品沒有副作用。麻醉后使用無菌的剪刀和鑷子解剖, 取得的斑馬魚腸道放在無菌的EP管中。隨后立即使用液氮冷凍, 放置在–80 °C, 用于后續提取DNA。

1.4 腸道生理指標的測定

把5條腸道混作一個樣, 加入9倍組織體積的生理鹽水。勻漿研磨充分后在3 000 r/min離心15 min, 取上清液。使用緊密連接蛋白ZO-2(TJP2)和乙氧基異戊二烯-O-脫乙基酶(EROD)的魚特異性酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒, 按照說明書檢測腸道中TJP2含量和EROD活性, 試劑盒購買于南京建成。

1.5 腸道微生物群落總DNA提取

把10條腸道混作一個樣, 向每管樣品加入1 mL裂解液, 在37 °C下水浴30 min, 加入蛋白酶K (100 μg/mL), 隨后55 °C水浴下裂解12 h, 在室溫下恢復溫度后, 離心取其上清液, 再進行抽提純化, 用氯化鈉(0.1倍體積)和無水乙醇(2倍體積)沉淀DNA, 3 h后用70%乙醇清洗DNA沉淀, 將DNA干燥后溶解于40 μL TE, 回收得到的DNA進行測序分析。

1.6 16S rRNA高通量測序和分析

提取好的腸道菌群DNA用微量核酸蛋白分析儀測定其濃度和純度, 以腸道細菌DNA為模板, 采用通用引物341F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)擴增出細菌16S DNA序列。在進行數據處理過濾時(Fadrosh, 2014), 使用內部撰寫的程序對原始的測序數據進行處理, 基于OUT (Operational Taxonomic Units)聚類的Vsearch方法進行序列拼接, 質量過濾, 去重, 聚類(Rognes, 2016)。使用樸素貝葉斯(Naive Bayes)分類器完成注釋, 根據注釋結果統計各樣本在不同分類水平中的分類單元數量(唐亞鵬等, 2022)。

2 結果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌暴露對斑馬魚腸道生理的影響

2.1.1 腸道中TJP2的含量 對暴露前后腸道中緊密連接蛋白TJP2的含量進行檢測, 結果如圖1, 在嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚12 h和24 h后, 腸道中TJP2的含量顯著降低(0.05,0.01)。

2.1.2 腸道中EROD酶活 檢測暴露前后腸道中EROD活性, 代表解毒能力的EROD活性隨暴露時間的增加而降低, 在嗜水氣單胞菌暴露24 h后, 斑馬魚腸道中EROD的活性顯著降低(0.01)。

圖1 斑馬魚腸道中TJP2的含量

注: 0表示未暴露前的斑馬魚腸道樣本, 6、12、24表示暴露后6 h、12 h、24 h的腸道樣本。數據表示平均值±標準誤差(mean±SEM)。*<0.05表示暴露組相對于未暴露組具有顯著差異, **<0.01表示暴露組相對于未暴露組具有顯著差異具有極顯著差異。下同

圖2 斑馬魚腸道中EROD的活性

2.2 嗜水氣單胞菌暴露對斑馬魚腸道微生物的影響

2.2.1 樣本數據統計和測序質量分析 高通量測序后, 如表1所示, 共獲得有效序列條數為475 434條。把序列按照隨機抽樣的方法, 通過測序數據量以及OTU數量構建稀釋曲線, 可見圖3中各樣本的曲線趨于平緩, 說明測序的數據量合理, 目前的OTU數量可以代表各組的微生物信息。

表1 各樣本數據信息統計

Tab.1 Statistics of the sample data

注: A、B、C、D組分別為暴露前和暴露后6 h、12 h、24 h的腸道樣本, 每組分別設置3個平行

2.2.2 基于OTU的VENN圖 VENN圖顯示樣本中共有和獨有OTU數目, 表明樣品OTU數目的組成相似性和重疊情況, OTU的豐度能夠初步體現樣品的物種豐富程度。如圖4所示, 未暴露前, 斑馬魚腸道細菌獲得OTU 368個, 在暴露后6 h、12 h、24 h后, 斑馬魚腸道細菌分別獲得OTU 246、253個、226個。

圖3 物種數目飽和度稀釋曲線

注: A組為未暴露前斑馬魚腸道樣本, B、C、D組分別為暴露后6 h、12 h、24 h的腸道樣本

圖4 基于OTU的VENN圖

2.2.3 腸道菌群的Alpha多樣性 Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析(Schloss, 2009), 反映樣品中群落的豐富度和物種均勻度。包括ACE指數、Chao指數和Richness指數等。它們的指數越大, 說明樣品中的物種越豐富。相比未暴露嗜水氣單胞菌的對照組, 在暴露6 h、12 h、24 h后, 暴露組的Alpha多樣性顯著降低(圖5)。

2.2.4 Rank曲線 Rank曲線能夠展現樣品的物種多樣性, 也能夠反映物種的均勻程度和豐富程度。樣品曲線越寬表示樣品中物種組成越豐富, 樣品曲線越平坦表示樣品中物種組成的均勻度越高。由此可見, 暴露嗜水氣單胞菌后, 斑馬魚樣品中物種組成豐富度降低(圖6)。

圖5 Alpha多樣性指數

圖6 基于OTU的Rank曲線

2.2.5 門和屬水平物種豐度 如圖7所示, 在門水平上, 對照組腸道菌群中, 變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)和放線菌門(Actinobacteriota)占主導地位, 但相對豐度不同。其中, 變形菌門所占比例為36.87%, 擬桿菌門所占比例為36.11%, 放線菌門所占比例為26.53%。值得注意的是, 在嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚12 h和24 h后, 放線菌門所占比例分別降低了28.95%和17.75%。

圖7 在門水平上的腸道菌群群落結構柱狀圖

在屬水平上(圖8), 與對照組相比, 暴露6 h、12 h、24 h后, 腸道菌群中顯著降低(0.05,0.05,0.05), 分枝桿菌屬()在暴露12 h、24 h后顯著降低(0.05,0.05), 腸道菌群中的不動桿菌屬()在暴露24 h后也明顯增加。

2.2.6 主成分分析(PCA) 采用無參數多變量方差分析, 比較樣本的群落組成。圖9的結果顯示, 在暴露嗜水氣單胞菌12 h、24 h之后, 斑馬魚腸道菌群的相似度發生了偏移, 樣品在OTU水平上的群落組成存在差異。

圖8 在屬水平上的腸道菌群群落結構柱狀圖

圖9 斑馬魚腸道菌群的主成分分析

注: 圖中點分別表示各個樣品。不同顏色代表樣品屬于不同的分組。A組為未暴露前斑馬魚腸道樣本, B、C、D組分別為暴露后 6 h、12 h、24 h的腸道樣本

3 討論

腸道是消化和吸收營養的主要器官, 其完整性對魚類的健康至關重要(Jutfelt, 2007)。腸黏膜屏障功能的損傷與多種腸道疾病的發生密切相關(關瑋, 2011), 緊密連接(tight junction, TJ)蛋白是腸上皮屏障的關鍵成分(Chasiotis, 2012), TJP2是最重要的TJ蛋白之一, 常被用作腸上皮屏障完整性和通透性的指標(Rhee, 2009)。本研究中, 在暴露嗜水氣單胞菌12 h、24 h后, 斑馬魚腸道中TJP2的含量顯著降低, 這表明, 嗜水氣單胞菌暴露損傷了腸上皮屏障的完整性, 提示了嗜水氣單胞菌對腸道功能有潛在的干擾作用。有研究表明, 感染嗜水氣單胞菌的斑馬魚, 腸道組織切片上可觀察到有明顯的腸道上皮損傷, 腸道上皮結構被破壞, 表現為上皮細胞脫落, 緣狀紋減少(Wang, 2016)。嗜水氣單胞菌可導致鯉魚腸道黏膜屏障損傷(Jung-Schroers, 2018)。嗜水氣單胞菌引起的金錢魚()細菌性疾病的發病金錢魚, 與正常的金錢魚相比, 其腸絨毛結構消失, 肌肉層疏松明顯(張慶華等, 2016)。

本研究中, 在暴露嗜水氣單胞菌24 h后, 斑馬魚腸道中EROD活性顯著降低。EROD活性變化能夠反映機體解毒代謝的能力(肖國強等, 2013), 是公認的魚類生物效應標記物(Kammann, 2005), 其活性可以指示暴露損傷(Whyte, 2000; J?nsson, 2003)。研究表明, 成年斑馬魚中, 暴露于50 mg/L對羥基苯甲酸甲酯(Methylparaben)會導致EROD活性顯著降低(De Carvalho Penha, 2021)。最高溫度導致暴露于除草劑丁硫脲(Butylthiourea)的美國牛蛙蝌蚪肝臟中EROD活性降低(Grott, 2021)。將黃蓋鰈()暴露于污染沉積物(低濃度多氯聯苯), 其EROD活性在140 d后下降22% (Livingstone, 1993)。本研究中, 暴露后腸道EROD活性的降低, 指示了嗜水氣單胞菌對斑馬魚腸道的生理損傷。

研究表明魚類在環境變化后, 一些從門到屬的OTUs會在腸道中大量改變(Adamovsky, 2018)。在本實驗中, 嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚后, 腸道菌群中OTU數量明顯下降。Rank曲線表明, 暴露后組別比暴露前組別分布更窄, 物種組成豐富度降低。PCA分析結果顯示, 暴露改變了斑馬魚腸道菌群的結構。通過Chao指數、Richness指數和ACE指數可以看出, 與對照組相比, 嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚后的Alpha多樣性顯著降低。很多研究也表明, 環境中的有害物質暴露能夠導致腸道菌群的改變以及Alpha多樣性的變化(Chen, 2018; Qiao, 2019)。重復損傷導致斑馬魚腸道屏障功能恢復受損, 腸道菌群失調(Chuang, 2019)。用含有二氯苯氧氯酚的食物暴露成年斑馬魚4～7 d, 可導致斑馬魚腸道菌群結構快速變化、Alpha多樣性顯著降低(Gaulke, 2016)。本研究中嗜水氣單胞菌暴露后, 斑馬魚腸道菌群失調, 表現為微生物物種組成減少, Alpha多樣性快速降低, 這指示了嗜水氣單胞菌暴露對斑馬魚的腸道損傷。與本研究結果不同的是, 采用長期浸泡的方法使嗜水氣單胞菌感染草魚, 導致草魚物種豐富度指數增加, Alpha多樣性有所增加(李東亮, 2016)。

在門水平上, 斑馬魚腸道菌群中變形菌門、擬桿菌門和放線菌門占主導地位, 但相對豐度不同。Roeselers等(2011)研究了在不同國家和地區的斑馬魚腸道菌群組成, 發現斑馬魚腸道中的核心菌群為變形菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門和擬桿菌門。在嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚12 h和24 h后, 放線菌門所占比例有所降低。本研究中, 在暴露嗜水氣單胞菌24 h后, 腸道菌群中的不動桿菌屬()大量增加。動桿菌屬是一種機會致病菌, 常存在機體呼吸道、消化道, 當機體抵抗力較低時可致病(袁秀梅等, 2001)。人工感染結果表明, 不動桿菌屬分離株對泥鰍、斑馬魚和線蟲()都具有致病性和高毒性(Wang, 2020)。本研究中腸道菌群不動桿菌屬的大量增加, 可能是導致腸道健康受損的原因。

腸道健康, 包括黏膜上皮屏障功能完整和微生物平衡(Bischoff, 2011), 腸道黏膜屏障將宿主內部與外部環境分隔開, 并阻擋潛在的有害物質(姚鵬等, 2021), 腸道微生物對維持腸黏膜屏障功能、調節免疫功能和促進營養物質的代謝吸收等具有重要作用(段云峰等, 2022)。研究表明, 牙齦卟啉單胞菌()通過IL9產生CD4+T細胞, 改變腸道菌群、破壞上皮屏障功能, 間接引發腸道炎癥(Sohn, 2022)?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌可改善拉氏鱥()腸道形態、消化和吸收酶活性, 增強腸道黏膜免疫和屏障功能, 維持腸道微生物平衡(Lei, 2022)。黏膜屏障功能障礙可能與腸道菌群失調有關(Xia, 2022), 石斛多糖能通過改善腸道屏障功能, 調節小鼠的腸道微生物群(胡乃華, 2022)。我們的研究結果表明, 嗜水氣單胞菌暴露引起了斑馬魚腸道生理損傷, 表現為腸道TJP2含量、EROD酶活性在暴露后顯著下調。分析斑馬魚體內的腸道菌群種類發現, 暴露后斑馬魚腸道內致病菌不動桿菌大量增加, 增加了腸道受損的可能性。進一步對腸道微生物群落結構分析表明, 嗜水氣單胞菌暴露顯著降低了斑馬魚腸道中的微生物Alpha多樣性。腸道中微生物的多樣性與改善腸道上皮和黏膜屏障功能緊密相關, 在本研究中, 腸道中致病菌的增加、Alpha多樣性的降低可能與TJP2含量、EROD酶活性降低有關。

4 結論

本研究用嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚, 在暴露后24 h內, 采用ELISA、16S rRNA高通量測序檢測腸道生理健康和腸道微生物變化情況。結果表明, 在嗜水氣單胞菌暴露后, 斑馬魚腸道健康受損。表現為斑馬魚腸道TJP2含量、EROD酶活性降低, 腸上皮屏障受損。同時, 腸道致病菌增加, Alpha多樣性降低, 菌群失調。本研究結果提示了嗜水氣單胞菌對腸道健康的損害與風險, 為腸道微生物與腸道生理健康的相互作用提供研究基礎。

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CAUSED INTESTINAL PHYSIOLOGICAL DAMAGE AND INTESTINAL MICROBIAL DISORDER IN ZEBRAFISH

SUN Wen1, 2, WANG Yong-Jie1, 2, BAO Jun-Jie1, 2, ZHANG Jing1, 2, CHEN Hong-Lian1, 2, XIONG Ying-Qi1, 2

(1. Fisheries Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China; 2. Key Laboratory of Aquaculture & Stock Enhancement in Anhui Provincial, Hefei 230031, China)

is widely distributed in nature, and is a typical opportunistic pathogen of common diseases of human and fish. To understand the mechanism of its infection to fish, zebrafish was taken for this study. The subcutaneous dermis of the sample fish was scratched, and the wounded fish was exposed tosolution at a concentration of 105CFU/mL for 6 h. Samples were taken at 0, 6, 12, and 24 h after exposure. The changes of intestinal physiological health and intestinal microbiota of the fish were analyzed. Fish specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit was used to detect the tight junction protein ZO-2 (TJP2) content and ethoxyisoprenoe-O-deethylase (EROD) activity in the intestine. Results show that after the exposure, the intestine of the zebrafish was damaged, and the intestinal TJP2 content and EROD enzyme activity were significantly down-regulated. As revealed by 16S rRNA high-throughput sequencing, the structures of intestinal microorganisms and their microbiota were altered,was significantly increased, the number of OTUs were significantly decreased, the Alpha diversity was decreased, and the dysregulation of the intestinal microbiota was caused. The diversity of intestinal microorganisms was closely related to the improvement of intestinal epithelial and mucosal barrier function. This study provided a reference for studying the toxicity offrom the perspective of intestinal health and exploring the pathogenic mechanism ofin zebrafish.

; zebrafish; intestinal microbial; Alpha diversity; TJP2

* 安徽省農業科學院科研團隊計劃項目, 2022YL010號; 安徽省現代農業產業技術體系建設專項, 皖農科函[2021] 711號。孫 雯, 碩士, E-mail: 936728828@qq.com

王永杰, 研究員, E-mail: hfwangyongjie@163.com

2022-10-08,

2022-11-17

S917.1

10.11693/hyhz20221000254