黃條(Seriola aureovittata)生長對工廠化養殖密度的微生態適應特性*

周鶴庭 徐永江 姜 燕 崔愛君 王 濱 柳學周

周鶴庭1, 2徐永江1①姜 燕1崔愛君1王 濱1柳學周1

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 深藍漁業工程聯合實驗室 山東青島 266071; 2. 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306)

魚類的養殖生長與健康水平受到多種因素的影響, 如低氧(王鵬飛, 2014)、鹽度(史寶等, 2020)、密度(張奇, 2020; 倪金金, 2020)等, 其中密度是一種關鍵的制約因素。已有研究表明, 適宜的養殖密度會促進養殖魚的生長, 較高的養殖密度會造成生長的遲滯和生理脅迫(宋志飛等, 2014; 韓岑等, 2017;張奇, 2020; 倪金金, 2020)。關于密度對魚類生長和健康影響的機制, 國內外諸多學者從魚類攝食(倪金金, 2020)、餌料轉化率(Yang, 2020)、養殖水質(Zahedi, 2019)等角度進行了研究和闡釋, 鮮見有從消化道微生態角度進行研究的報道。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源與實驗設計

使用容積為3 m3圓柱形玻璃缸水槽作為試驗容器。實驗設置低密度組(5 kg/m3)、中密度組(10 kg/m3)、高密度組(15 kg/m3)等三個實驗組, 每個實驗組設置一個重復。實驗魚放入各密度組暫養適應7 d后正式開始。實驗采用流水養殖方式, 日換水率在400%以上。整個實驗過程中, 養殖水溫保持在22～27 °C, 鹽度31～32, 溶解氧>6 mg/L。實驗期間投喂冰鮮玉筋魚, 投喂量為魚體重的3%～5%, 均飽食投喂。每天投喂后1 h清理養殖水槽, 保持底部清潔。

1.2 實驗樣品采集與處理

實驗結束后, 實驗魚經MS-222麻醉(80 mg/L)后, 測量體重、體長, 用一次性注射器于尾部靜脈取血, 血液樣本在室溫下靜止10 min后離心(4 °C, 4 000 r/min, 10 min), 取血清保存在液氮中, 用于皮質醇和葡萄糖等指標分析。消化道菌群樣本采集時, 先采用75%酒精棉擦拭體表, 隨后解剖并快速取胃、幽門盲囊、腸道三個組織, 排出組織內殘余內容物, 采用預冷的生理鹽水沖洗后分裝保存于液氮中。

工廠化養殖車間內每個實驗組取樣三尾魚的消化道各個組織部位作為平行樣品, 故樣品命名情況如下: C2AS為低密度(A)組胃部(Stomach), C2BP為中密度(B)組幽門盲囊(Pyloric caecum), C2CG為高密度(C)組腸道(Intestinal), 依次類推命名樣品。

1.3 生長與血清指標計算

生長參數的計算按照下述公式進行:

增重率(Weight gain ratio, WGR,%) = [(t–0)/0]×100, (1)

特定生長率(Specific growth ratio, SGR,%/d) =[(lnt–ln0)/]×100, (2)

肥滿度(Condition factor, CF, g/cm3) =t/3, (3)

上述式中,0、t分別為試驗初始和結束平均魚體質量(濕重, g);為試驗天數(d);為體長(cm)。

血清指標包括: 皮質醇、葡萄糖。上述指標均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒, 嚴格按照其操作說明完成測定。

1.4 微生物總DNA提取與高通量測序

1.5 數據處理與統計分析

高通量測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別分析轉化為FASTQ格式的原始測序序列, 經過一系列剪切、去雜、拼接、質控和去除嵌合體后得到有效序列。根據序列的相似性, 將序列歸為多個可分類操作單元(OTU), 序列相似度≥97%被歸為一個OTU單元。使用QIIME軟件包選取每個OTU中豐度最大的序列作為該OTU的代表序列(tags), 并將所有代表序列與Silva(version123)數據庫進行比對注釋, 物種比對注釋使用RDP classifier軟件, 保留置信區間大于0.7的注釋結果。采用tax4fun(0.3.1)對微生物群基因參與的KEGG通路進行比對分析。

2 結果

2.1 不同密度下黃條的生長與生理指標差異

在工廠化不同養殖密度下, 經過60 d養殖后, 低密度組實驗魚終末體質量顯著高于高密度組(<0.05),增重率和特定生長率顯著高于中、高密度組(<0.05), 另外, 低密度組實驗魚血清中皮質醇、葡萄糖水平顯著高于中、高密度組(<0.05), 而中、高密度組之間的生長和生理指標均無顯著性差異(>0.05) (圖1、表1)。

2.2 不同養殖密度黃條消化道菌群多樣性

圖1 不同密度下黃條的養殖生長指數

注: 不同上標小寫字母表示同一指標不同密度組之間的差異顯著性(<0.05); 下同

Tab.1 Blood cortisol and glucose levels in S. aureovittata indifferent stocking densities

注: 不同小寫字母上標表示不同密度組間的顯著性差異(<0.05)

圖2 胃部、幽門盲囊、腸道微生物OTU的Venn圖

注: 從左至右依次為胃部、幽門盲囊、腸道; A、B、C分別代表低、中、高密度組; 下同

表2 消化道樣品微生物多樣性指數

Tab.2 Diversity index of microorganism in digestive tract samples

注: 不同上標小寫字母表示不同密度組實驗魚同一組織部位之間的差異顯著性(<0.05)

2.3 基于門水平黃條消化道的菌群結構

胃部的菌群變化體現以下兩個方面: 變形菌門、軟壁菌門在低密度組中的相對豐度占比遠低于中、高密度組, 而擬桿菌門等優勢菌門在低密度組中的相對豐度占比都高于中、高密度組。幽門盲囊和腸道中的門水平菌群變化情況同胃部基本一致。以上結果表明, 一方面胃、幽門盲囊和腸的菌群組成一個穩定的微生態環境, 菌群豐度的變化趨勢基本同步; 另一方面, 低密度組同中、高密度組相比, 門水平上的各菌群豐度值出現了較大的波動, 但菌群組成并無明顯變化(圖3)。

2.4 基于屬水平黃條消化道的菌群結構

圖3 基于門水平的黃條消化道菌群結構

圖4 基于屬水平不同密度養殖的黃條消化道優勢菌群結構

圖5 基于屬水平不同密度養殖的黃條消化道優勢菌群差異

注: L、M、H分別表示低、中、高密度組, *表示該菌屬的低密度組和中、高密度組間具有差異顯著性(<0.05)

2.5 基于KEGG通路分析黃條消化道微生物菌群功能

通過KEGG分析, 在一級通路水平, 各密度組消化道中的菌群功能主要集中在代謝(Metabolism)、環境信息過程(Environmental Information Processing)、遺傳信息過程(Genetic Information Processing)等三個方面, 低密度組中消化道菌群參與功能通路的基因數目遠低于中、高密度組, 同時中、高密度組在代謝、環境信息過程和遺傳信息過程三個通路中注釋的tags數目遠大于低密度組(圖6)。二級通路中, 碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子、維生素的代謝、核苷酸代謝、脂質代謝、膜運輸、信號傳導、翻譯、轉錄和折疊、分類和降解等通路均出現低密度組顯著低于中、高密度組(<0.05), 中、高密度組之間無顯著性差異的情況(>0.05) (圖7)。

3 討論

3.1 不同養殖密度下黃條的生長差異

圖6 黃條消化道菌群KEGG一級通路功能注釋

注: *表示該功能通路中, 低密度組和中、高密度組間具有差異顯著性(<0.05)

3.2 不同養殖密度下黃條消化道菌群多樣性變化

3.3 不同養殖密度下黃條消化道菌群結構特性

克雷伯氏菌屬和同屬變形菌門, 這兩種菌屬在中、高密度組中的增加是引起變形菌門豐度值變化的原因?？死撞暇鷮偈浅Ｒ姷臈l件致病菌屬, 當宿主機體健康狀態下降、有益菌豐度降低時, 平衡狀態被打破, 即可導致宿主發病?？死撞暇鷮傧掠蟹窝卓死撞?)、產酸克雷伯菌()等眾多細菌, 但肺炎克雷伯菌在水生動物中多次被發現并報道, 在發病的鯉魚() (盧玉婷等, 2014)、出現爛鰓的白鰱() (唐毅等, 2007)、暴發出血病的團頭魴() (滕濤等, 2016)中均分離或鑒定出該菌。本次研究中高密度組養殖魚消化道中的克雷伯氏菌屬上升, 雖然未出現病理表現, 但與生長指標和血清皮質醇等生理指標方面的表現相一致, 存在暴發疾病的潛在風險。

3.4 不同養殖密度下黃條消化道菌群功能注釋分析

4 結論

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ROLE OF GASTROINTESTINAL MICROBIOTA IN GROWTH REGULATION OF YELLOWTAIL KINGFISHUNDER INDOOR TANK CULTURE IN DIFFERENT STOCKING DENSITIES

ZHOU He-Ting1, 2, XU Yong-Jiang1, JIANG Yan1, CUI Ai-Jun1, WANG Bin1, LIU Xue-Zhou1

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Joint Laboratory for Deep Blue Fishery Engineering, Qingdao 266071, China; 2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The effects of low (5 kg/m3), medium (10 kg/m3) and high (15 kg/m3) densities on the growth of yellowtail kingfishin industrial farming were studied, and the density adaptability of yellowtail kingfish was analyzed from the perspective of digestive tract microbiota. Using Illumina Miseq platform, 16S rRNA high-throughput sequencing was carried out for detecting the digestive tract (stomach, pyloric caecum, and intestine) microbiota of yellowtail kingfish cultured in different densities, and the diversity index, structural characteristics, and gene function of the microbiota were predicted and analyzed. Results show thatcompared to the medium- and low-density groups, the final body mass and specific growth rate of fish in the high-density group was significantly (<0.05) inhibited, and the serum stress-related hormones were upregulated significantly. At the genus level,,,,, andwere decreased in the medium- and high-density groups, and the abundance ofwas increased in medium- and high-density groups, which were significantly different (<0.05) from that of the low-density group. KEGG pathway analysis showed that the microbiota genes of each density group were involved in three main functional pathways of metabolism, environmental information processing, and genetic information processing. Compared with the low-density group, the composition and structure of gastrointestinal microbiota in the medium- and high-density groups showed a significant decrease (<0.05) in beneficial bacteria () and a significant increase in conditional pathogenic bacteria (). In terms of microbiota function, the total number of genes involved in functional pathways of digestive tract microbiota in the medium and high-density group was increased significantly (<0.05) from that of the low-density group. Especially, the numbers of genes involved in the three functional pathways involved in the three main functional pathways were significantly greater (<0.05) than that those of the low-density group. This study provided a theoretical basis for good control on the density of factory culture of yellowtail kingfish and for the development of healthy culture technology.

; stocking density; physiological stress; microbiota structure; micro-ecological response

* 國家重點研發計劃項目, 2022YFD2401102號; 青島海洋科技中心山東省專項經費, 2022QNLM30001-1號; 中國水產科學研究院基本科研業務費, 2020TD47號; 農業農村部財政專項-海洋漁業生物資源收集與保藏項目; 財政部和農業農村部: 國家現代農業產業技術體系, CARS-47號。周鶴庭, E-mail: zhouheting1023@163.com

徐永江, 研究員, E-mail: xuyj@ysfri.ac.cn

2022-12-31,

2023-03-24

S965; Q953; S955

10.11693/hyhz20221200344