中藥材組培脫毒技術研究進展

高文敬，董景湘，劉靈娣*

（1.河北省農林科學院經濟作物研究所/河北省藥用植物工程技術研究中心，河北 石家莊 050051；2.河北省農林科學院，河北 石家莊 050051）

中藥材為具有道地性和中國特色的原生藥材，是藥用植物產業發展的基礎，其種類繁多，開發潛力大，蘊藏量較為豐富，在長期發展和使用中獲得了醫生和患者的高度認可[1]。隨著醫藥學和農業的發展以及新冠疫情的出現，人們對中藥材的重視程度加大，中藥材市場需求量越來越大，導致大量中藥材野生資源被過度采挖，其野生環境遭到嚴重破壞，蘊藏量急劇下降。近年來，為解決中藥材市場需求和資源供應不足等問題，中藥材種植業得到了快速發展，但在種植過程中由于植物病毒在其體內不斷積累，致使中藥材產量和品質受到嚴重影響，甚至造成絕產和種質退化等多種問題[2]。而目前，中藥材病毒病還沒有行之有效的辦法根治。為了更好地保護、開發和利用中藥材種質資源，利用組織培養的方式培養脫毒苗是有效控制和消除中藥材病毒病的關鍵所在，也是中藥材達到商品化、產業化、標準化、規范化生產需要解決的首要問題。現已有報道的中藥材脫毒方法多種多樣，主要包括熱處理、莖尖組培、熱處理+莖尖組培脫毒、化學法、物理法、基因編輯法等。對近年來中藥材組織培養脫毒技術研究進展進行系統綜述，以期為中藥材組培脫毒技術的更深入研究提供參考。

1 中藥材常見病毒病的種類

中藥材種類繁多，其病毒種類也多種多樣，中藥材感染的病毒主要包括黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、大蒜潛隱病毒（GLV）、韭蔥黃條病毒（LYSV）、馬鈴薯A 病毒（PVA）、馬鈴薯M 病毒 （PVM）、馬鈴薯 S 病毒 （PVS）、馬鈴薯 Y 病（PVY）、百合無癥病毒 （LSV） 和番茄不孕病毒（TAV）等[3]。不同中藥材病毒病的研究程度不一致，有些中藥材會遭到多種病毒侵染，并具有傳播迅速、病癥復雜、病毒在植株內分布不均、初侵染與再侵染特征不一致等特點[4]。綜合來看，前人對出現花葉、皺葉、條紋、斑駁、壞死、畸形等表型明顯的病毒研究較多，對表型不明顯的病毒研究較少。

2 中藥材組培脫毒技術研究現狀

2.1 熱處理脫毒技術

植物脫毒技術是近幾十年來才逐漸發展起來的，熱處理脫毒是最早應用的一種脫毒方法，解決了部分病毒病害造成的減產問題[5]。熱處理是利用某些病毒較寄主植物對溫度敏感、對高溫忍耐度較差的特性，通過高溫處理，使病毒失活發生鈍化，病毒的繁殖和擴散速度得到控制的一種處理方式。經較長時間高溫處理后，由于寄主植物的生長速度快于病毒的傳播速度，因此病毒含量會慢慢減少，隨后將生長較快、不含病毒的組織切取后進行組織培養，最終可得到脫毒苗。世界上已知脫除病毒最早的例子是用熱處理脫除馬鈴薯卷葉病毒（PLVR）[6]。早在1889 年印度尼西亞爪吐人就用50 ℃左右的熱水浸泡用于繁殖的甘蔗莖段來防止病毒病的發生，現在許多國家在種植甘蔗前仍使用這種處理方法[5]。熱處理技術也被廣泛應用到各種中藥材的脫毒過程中。一般采用35～55 ℃的熱水或高溫蒸汽、高溫空氣，根據外界溫度和外植體的不同決定熱處理的時長[7]。吳群英等[8]對羅漢果組培苗進行38.5 ℃高溫處理10 d，得到了完全脫毒的羅漢果健康種苗。肖穎等[9]分別在 20、25、30、35、40、45 ℃高溫條件下對息半夏組培苗進行脫毒處理，利用顯微鏡檢測法檢測脫毒情況，結果顯示，在一定溫度范圍內，脫毒率隨著溫度的升高而明顯提高。隨著研究的深入和技術的不斷進步，目前常采用熱處理與其他脫毒技術相結合的方法對中藥材進行脫毒。

2.2 莖尖培養脫毒技術

病毒在植株體內的分布并不均勻，其中莖尖分生組織生長較快且無維管束，病毒感染程度較低，莖尖生長點區域幾乎沒有病毒[10]。莖尖培養脫毒技術最早是1952 年法國學者Morel 等[11]在大麗菊上應用成功；之后，隨著植物組培技術的進步和完善，該方法得到了廣泛應用，目前在中藥材上已經應用于貢菊、滁菊、地黃、太子參、丹參、半夏等的脫毒，并獲得了脫毒組培苗[12，13]。莖尖脫毒既能夠在很大程度上保持遺傳性狀的穩定，又能夠脫除一些具有潛在威脅的真菌和細菌，因此深受研究人員的重視。莖尖脫毒技術的重點是切取莖尖的大小和培養基的篩選。莖尖太小會大大降低成活率，莖尖太大則會影響脫毒效果，研究表明，切取長0.2～0.5 mm 的莖尖進行培養既可以保證一定的成活率，又可以最大程度地提高脫毒效率[14～16]。在馬鈴薯上，切取長0.2 mm 左右的莖尖進行培養，成活率和脫毒率分別達到68%和56%[14]。在百合上，剝取長0.2～0.5 mm 的莖尖分生組織進行培養，脫毒效果和成活率均較好[15，16]。王寶霞等[17]對半夏莖尖愈傷組織誘導的培養基進行了優化，確定最佳培養基為 MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+瓊脂 7 g/L+蔗糖30 g/L，并可一次性成苗，經檢測TMV、CMV 和SMV 脫毒率均達到100%。張淑娟等[18]篩選出唐菖蒲莖尖叢生芽的最佳誘導培養基為6-BA 0.5～2 mg/L+NAA 0.05～0.2 mg/L，叢生芽增殖初期效果最好的培養基為 2/3MS+6-BA 1.0～1.5 mg/L+NAA 0.10～0.15 mg/L，最佳生根培養基為1/2MS+NAA 0.3 mg/L，經檢測，供試的5 個品種均不帶菜豆黃花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草環斑病毒和蠶豆萎蔫病毒。

2.3 熱處理＋莖尖培養脫毒技術

采用莖尖脫毒培養技術，通常需切取非常短的莖尖，且還需在顯微鏡下進行，因此實際操作起來費時費力，且脫毒效果也不特別理想。研究發現，將熱處理與莖尖脫毒培養結合起來，可使脫毒率得到一定幅度的提升[5]。曹有龍等[19]切取枸杞莖尖置于38 ℃高溫環境培養28～30 d，之后轉入生根培養基中培養，恢復生長后得到組培苗，移栽后經檢測均未攜帶病毒，采用熱處理+莖尖培養脫毒技術在很大程度上提升了脫毒效果。江洪如等[20]將外植體置于溫箱中先58 ℃處理10～20 min，再 38 ℃處理 72 h 后，切取長 0.2～0.4 mm的莖尖進行培養，可獲得完全脫去4 種主要病毒的百合脫毒苗。濕春秀等[21]以3 個種類的丹參為試材，將其試管苗置于光照培養箱中37～38 ℃恒溫培養38 d后，利用雙目體視顯微鏡在無菌條件下切取長0.2～0.4 mm的莖尖，隨后放到配制好的培養基上進行培養，最后得到組培苗，檢測結果顯示，3 個種類的丹參均已脫除CMV 病毒；但不同類型丹參的脫除率存在較大差異，其中皺葉丹參脫毒率高達80%，大葉丹參脫毒率為40%，而狹葉丹參脫毒率僅為20%。說明在不同種類的中藥材上，熱處理+莖尖培養脫毒技術的使用效果不同，需要進一步探索其他方法。外植體的成活率直接影響脫毒效率，隨著熱處理時間的延長，成活率逐漸降低。近幾年，很多研究人員傾向于利用變溫處理與莖尖脫毒培養相結合的方式進行脫毒處理。顧沛雯[22]研究發現，脫毒過程中采用熱處理與莖尖培養相結合的方法可使葡萄組培苗的成活率和脫毒率均較單純莖尖培養有所提高，其中，白天38 ℃/夜晚32 ℃變溫處理的成活率較38 ℃恒溫處理提高15.6%，而脫毒率無明顯差別。石貴玉等[23]在毛葡萄上進行了組培脫毒技術研究，發現白天37 ℃時長8 h/夜晚22 ℃時長16 h 處理10～15 d，莖尖成活率可達80%以上，脫毒率高達100%。

2.4 愈傷組織誘導脫毒技術

愈傷組織誘導脫病毒技術是通過對植株或部分組織進行培養，誘導產生愈傷組織，分化出芽后形成植株，經病毒檢測篩選出無毒苗的方法。該方法可行性強，適用于實驗室研究，具有周期較短、一次性成苗數量多等優點，已經在很多中藥材脫毒中應用。愈傷組織誘導通常選擇嫩葉、花藥、株芽、莖尖等作為外植體。謝紅娥等[24]對半夏葉片、葉柄、株芽進行消毒處理后置于附加不同外源激素的培養基中進行愈傷組織誘導，發現6-BA 2.0 mg/L 附加適量的NAA、GA3對珠芽增殖有促進作用，還可促進試管苗的生長速度；IAA 0.2～0.5 mg/L 可促進半夏根系生長；6-BA 2.0 mg/L、GA30.2 mg/L 配合適當濃度的2，4-D 和NAA，可促進半夏葉片愈傷形成，促使其直接長出根和葉片；利用6-BA 1.0～2.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L 可誘導莖尖一次性成苗，病毒脫除率達到80%。彭向前等[25]對半夏株芽進行處理，篩選出適宜半夏脫毒苗繁殖的培養基，結果顯示，在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.10 mg/L 培養基中誘導效果較好，脫毒率可達100%。王寶霞等[17]成功建立了能夠一次性成苗的再生體系，可以快速、高效地通過莖尖誘導半夏無毒苗，篩選出最佳誘導培養基為MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L，并可一次性成苗，經檢測TMV、CMV 和SMV 脫毒率均達到100%。

2.5 超低溫保存脫毒技術

長期以來，超低溫技術用于大多數植物種質資源的保存。近幾年，研究人員發現超低溫可以殺死病毒，超低溫脫毒技術逐漸發展和應用到植物脫毒中來，并成為一項對多種植物病毒脫除效率較高的理想方法。其具體操作方法是將植物試材在超低溫保護劑的保護下放入-196 ℃的液氮中處理，然后再解凍，通過組培的方法使其分化成完整植株[26]。超低溫脫毒的最佳試材是植株莖尖頂端分生組織，其細胞體積小、含水量較低，抗低溫能力較強，可以在低溫條件下存活，進而達到脫除病毒的效果。試材經超低溫處理后，即使切取較大的莖尖，也能確保形成的再生植株為脫毒苗。該技術操作較為容易，且節省成本，脫毒苗成苗速度更快。Brison 等[27]采用超低溫脫毒的方法首次成功脫去了李樹痘病毒（PPV），脫毒率達到50%，較傳統莖尖脫毒技術獲得的無菌苗脫毒率提升了30%。Wang 等[28，29]采用超低溫法去除了葡萄病毒A（GVA）、馬鈴薯Y 病毒（PVY） 和馬鈴薯卷葉病毒（PLRV），脫毒率較高，其中對GVA 的脫毒率達到了97%，明顯高于傳統的莖尖脫毒技術的脫毒率（僅12%）。白建明等[26]分別采用超低溫保存法和3 種常規方法（莖尖分生組織培養、熱處理、熱處理+莖尖分生組織培養）對馬鈴薯試管苗的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）和馬鈴薯X 病毒（PVX）進行脫毒，結果表明，馬鈴薯莖尖經超低溫保存后存活率和成苗率均高于常規方法處理。靳慧潔[30]通過超低溫脫毒+莖尖培養相結合的方法成功獲得了百合脫毒苗。戴軍等[31]將太子參超低溫處理1 h，在適宜生長發育的條件下培養，可使脫毒率達到90%，生產的脫毒苗可以滿足規模化種植需求。有研究發現，超低溫脫毒還可以脫除一些傳統脫毒方法不能脫除的病毒。

2.6 其他脫毒技術

除以上脫毒技術外，還有很多其他方法應用到中藥材的脫毒中來，如花藥和花粉培養、珠胚心培養、莖尖微嫁接技術、病毒抑制劑處理以及多種方法結合的形式，但由于中藥材種類繁多，因此不同種類、不同品種甚至不同株系的脫毒效果存在較大差異。

綜合來看，在中藥材脫病毒研究中，熱處理+莖尖培養脫病毒技術最成熟，使用最多；超低溫脫毒技術脫毒效果最好，但應用和報道較少，還需要進一步探索，該方法具有非常廣闊的應用前景。

3 病毒檢測技術

通過各種脫毒技術獲得的脫毒苗要想在生產中推廣，還需要經過嚴格的檢測，確定植株脫毒成功后才能應用。目前常用的病毒檢測方法仍以傳統方法為主，主要包括酶聯免疫吸附法（ELISA）、電鏡檢測和指示植物法。

ELISA 法是目前應用最多的病毒檢測方法，通過抗原與抗體免疫反應利用酶的高效催化反應進行測定，具靈敏度較高、測定迅速、能同時測定多個樣品的特點，但植物病毒抗原性較差，可能會發生假陽性反應，在一定程度上造成檢測結果不準確[3]。

RT-PCR 檢測方法是指通過體外快速擴增特定基因或DNA 序列進行結構和功能分析的方法。該方法靈敏性很高、結果精確，還可與其他檢測方法搭配使用，廣泛應用于各個學科。

電鏡檢測是一種非常重要的病毒檢測手段，通過觀察病毒的形態、大小和組織結構，確定脫毒苗是否完全脫毒。該方法對技術和儀器要求很高，所需顯微鏡非常昂貴，因此未得到廣泛推廣。

指示植物法是病毒檢測中應用較早的一種方法，其原理是指示植物對某些病毒很敏感，葉片受到病毒侵染后會產生明顯的癥狀。操作上一般是蘸取待測植株汁液摩擦指示植物的葉片，觀察一段時間后看是否出現明顯的病癥。該方法操作簡單、方便觀察，但癥狀顯示速度慢，觀察周期長，受季節和環境變化影響大，因此無法廣泛應用。

4 問題與展望

隨著科學技術的發展，組培脫毒技術在多種作物上得到應用，經過組培脫毒得到的脫毒苗也逐漸在規模化、商業化生產中應用，提升了作物產量和品質，脫毒技術研究和應用逐步從單一脫毒方法向2 種或多種方法相結合發展，不斷提高了成活率和脫毒率。由于中藥材研究起步較晚，研究經費和經驗不足，目前可應用到規模化、商業化生產中的中藥材脫毒苗較少，且脫毒技術還需要進一步研究。

目前中藥材研究中較為成熟的脫毒技術是熱處理+莖尖培養脫毒，雖然應用廣泛，且取得了較好效果，但還有較大的提升空間。另外，超低溫脫毒技術較傳統脫毒技術效率高、脫毒效果好，是一個非常具有應用前景和研究價值的技術，但目前在中藥材脫毒上還未得到充分應用。以往中藥材脫毒研究內容大多集中在脫毒技術和培養條件的優化上，對病毒檢測方法的研究較少，而現有的檢測方法尚存在一些不足和弊端，如需要多種檢測方式反復檢測最終才能得到確切結果，費時費力，因此，發展和優化病毒檢測方法是今后研究的一個重要方向。通過現有技術和農作物成功經驗，加大中藥材脫毒研究投入，不斷優化和發展脫毒技術和檢測方法仍然是提高成活率和脫毒率，實現脫毒苗商業化種植應用的重點。將基礎研究成果早日應用到實際生產中，加速成果轉化進程，實現產業化、規模化、商業化應用和推廣，促進中藥材產業的發展。