細胞外囊泡在泌尿系腫瘤診斷中的研究進展

金久凱，龐百仞，蔣軍輝

作者單位： 315211 寧波，寧波大學醫學部（金久凱）；寧波大學附屬第一醫院（龐百仞、蔣軍輝）

前列腺癌（PCa）、膀胱癌（BCa）和腎癌是最常見的三大泌尿系腫瘤，盡管目前早期發現腫瘤的比例越來越高，但仍需要新的生物標志物來提升泌尿系腫瘤的診斷效果。本文對細胞外囊泡（EV）不同亞型、表征方法、泌尿系腫瘤EVRNA標志物及臨床應用前景進行綜述，為未來泌尿系腫瘤診斷中應用新的生物標志物提供思路。

1 泌尿系腫瘤概況

1.1 PCa 近年來中國PCa患者顯著增加，2022 年預計死亡人數達56239 例[1]。前列腺特異性抗原（PSA）已被廣泛用于篩查PCa，但PSA敏感性特異性不強，早期檢出率較低。MRI 等影像學方法無法做到早期診斷。前列腺穿刺活檢即使采用多點活檢仍可能有較高的假陰性率。

1.2 BCa BCa 發病率及死亡率高居前列。膀胱鏡檢查是BCa 初步診斷的首選。細胞學檢查因其極高的特異性也是初始檢查的重要方式。核基質蛋白（NMP22）、膀胱腫瘤抗原（BTA）等尿液標志物和增強成像目前并未十分成熟[2]。

1.3 腎癌 腎癌絕大多數為腎細胞癌（RCC），死亡率為30%～40%，而PCa 和BCa 的死亡率約為20%[3]。早期RCC大多無癥狀，發現主要依賴于影像學檢查，目前暫無公認的用于RCC 早期診斷的腫瘤標志物。

1.4 其他 腎盂癌和輸尿管癌等上尿路尿路上皮癌（UTUC）并不常見，無創診斷方法也并未滿足臨床需求。

早期診斷泌尿系腫瘤可以顯著降低死亡率并挽救生命，然而現有的診斷策略并非令人滿意。因此研發一種高靈敏度和高特異性的方法來補充診斷泌尿系腫瘤迫在眉睫。

2 EV 及不同亞型

EV 是由各種細胞類型分泌的納米級細胞器樣膜囊泡，由磷脂雙分子層包裹，其含有核酸、蛋白質和脂質等，可動態參與細胞間通訊[4]。幾乎所有細胞都會釋放EV 到細胞外空間，它攜帶來自原始細胞的復雜生物信息，是以無創方式進行腫瘤診斷的重要來源[5]。近來發現細胞會釋放多種EV 亞型并具有不同的生物特性和生物學功能。本文采用大小劃分EV 并介紹了最新進展，見圖1。

圖1 EV 不同亞型

2.1 大細胞外囊泡（lEV，直徑＞200 nm） lEV 根據自身特征可分為遷移體（500 ～3 000 nm）、凋亡小體（1 000 ～5 000 nm）和原癌小體（1 ～10m）。

2.1.1 遷移體 遷移體是在遷移細胞收縮纖維上形成的囊泡，其中還包含直徑50 ～100nm的小泡，因此也被稱為石榴體（PLS）。除了參與細胞遷移，它在穩態維持、物質傳遞、信號整合等方面也起重要作用[6]。

2.1.2 凋亡小體 凋亡小體是相對較大尺寸的泡狀小體，主要在細胞凋亡過程中產生。近年來發現它也參與細胞清除、組織穩態、免疫等諸多過程[7]。

2.1.3 原癌小體 原癌小體是另一類腫瘤衍生的EV，其有著非典型的大尺寸及豐富的致癌內容物，負責致癌信號的細胞間轉移，并與PCa 密切相關[8]。

2.2 小細胞外囊泡（sEV，直徑＜200 nm） 外泌體是最具代表性的sEV，直徑30～150nm，通過傳遞核酸、蛋白質和脂質等貨物來調節細胞內通訊[9]。Zhang 等[10]鑒定出兩個外泌體亞群：直徑為90～120nm的大外泌體（Exo-L）和直徑為60 ～80nm 的小外泌體（Exo-S），二者具有不同的分子特性，動物實驗表現出不同的生物分布，表明它們在細胞間通訊中可能具有不同的功能。

2.2.1 外泌顆粒 Zhang 等[10]首先提取了一種直徑35nm 的納米顆粒，命名為“外泌顆粒”。它與sEV 相比，表現出不同的蛋白質、脂質、核酸譜，主要與肝臟中細胞融合，并可改變靶細胞的免疫功能。

2.2.2 超微粒 Zhang 等[11]鑒定了另一種細胞外納米顆粒，其從前述“外泌顆粒”的上清液中提取出，并被命名為“超微粒”。它在形態和分子上與外泌顆粒不同，在體內顯示出更高的富集，并且富含多種潛在的生物標志物，可能與癌癥有著緊密聯系。

3 細胞外囊泡的表征

3.1 表面等離子體共振（SPR） SPR傳感器代表EV表征中的一種新方法，具有無標記實時檢測和少樣品處理的優點。Min 等[12]開發了一種名為“nPLEX-FL”的納米等離子體傳感平臺，該平臺通過使用金納米孔提高靈敏度，對單個EV 上的目標表面和內部標記進行多重分析。Chen 等[13]報告了一種基于水凝膠-AuNP超分子球（H-Au）的SPR 生物傳感器用于分析PCa 衍生的EV，并在人血清分析中表現出較好的實用性。

3.2 EV 成像的顯微鏡技術 近年來用于EV可視化的顯微鏡技術取得了巨大進步。Goughnour 等[14]通過實驗證明了冷凍電鏡與免疫金標記相結合，提供有關EV攜帶特定分子的證據。Bairamukov 等[15]應用AFM 技術來研究空氣和液體中不同EV亞型的納米力學特性，它們的顯著差異為正確區分EV亞型提供了新的支持。

3.3 電阻脈沖傳感（RPS） 可調RPS（TRPS）檢測通過納米孔顆粒的電阻來對EV 的尺寸和濃度進行測量。改進這項技術得到了微流控電阻脈沖傳感（MRPS），二者不同之處在于MRPS 使用的濾芯是剛性預校準孔，而TRPS 使用的傳感孔可以拉伸以調整孔徑。Cimorelli等[16]開發了一種可重復的操作程序，應用MRPS 探索測量粒徑分布的最佳稀釋劑和樣品稀釋度。

3.4 納米流式細胞術（nanoFC） nanoFC與傳統FC相比，較小的通道減少背景信號，較低的系統壓力增加顆粒的停留時間，從而增強信號的集成。Liu 等[17]通過nanoFC 同時實現單個EV（可低至40nm）的光散射和熒光檢測，分析結直腸癌和鼻咽癌細胞系單囊泡水平的EV-DNA，同樣該技術有望用于泌尿系腫瘤。

3.5 拉曼光譜（RS） RS是一種基于激光與分子振動相互作用的無標記光譜，能夠在幾乎沒有預處理步驟的情況下分析樣品。Qian等[18]使用表面增強RS（SERS）來快速準確地分析EV，發現血清衍生的EV診斷泌尿系腫瘤具有很高的準確性。

雖然EV 表征方法取得了巨大進步，但目前還無法做到精準鑒別EV 及其亞型。對于高異質性的EV 亞型及共分離的非EV 雜質，現有表征方法易將其歸為一類，極大干擾后續EV 生物特性、所發揮的功能機制和工程化治療的研究。高效、快速地檢測和表征分析EV 的技術仍需探索。

4 泌尿系腫瘤診斷相關的EV RNA 標志物

LI 等[19]指出血漿miR-141-5p 有希望區分PCa，曲線下面積（AUC）為0.652；對于miR-125a-5p，AUC為0.691；而二者比值AUC值為0.793，比單一應用更合適。miR-217、miR-23b-3p、miR-30b-3p、miR-126-3p和circ_0044516 都有作為PCa潛在標志物的能力[20-22]。Li 等[23]發現miR-375、miR-451a、miR-486-3p 和miR-486-5p 可用于區分PCa 與健康對照者。Gan 等[24]得出PCA3 聯合PSMA 是區分PCa 患者和健康者的最佳組合（AUC 為0.870）。ERG、PSMA、PCA3、CK19和EpCAM 在PCa 中也有診斷潛力。

研究發現lncLNMAT2、TERC、miR-19b1-5p、136-3p 及139-5p 可區分BCa 與健康對照組[25-27]。不同的RNA組合診斷性能優于尿液細胞學檢查，可為診斷BCa 提供較高的敏感度和特異性[28-29]。Abbastabar 等[30]提出ANRIL 和PCAT-1 診斷BCa 時AUC為0.7229 和0.7292。El-Shal 等[31]指出miR-96-5p 和miR-183-5p 聯合診斷BCa 的敏感度為88.2%，特異性為87.8%，均高于獨自使用。Lin 等[32]驗證了miR-93-5p、miR-516a-5p 的BCa 診斷性能，AUC 為0.838 和0.790，也顯著高于尿液細胞學檢查（0.630）。

Xiao等[33]對RCC和健康個體的血漿衍生EV進行高通量測序，揭示has-miR-92a-1-5p、has-miR-149-3p 和hasmiR-424-3p差異表達且具有診斷價值。miR-155和miR-224-5p作為尿RCC 診斷的EV 生物標志物也有潛在價值[34-35]。

5 臨床應用難點及解決方案

5.1 分離過程 因EV不同的理化特性，樣品預處理的標準化是EV 分離與檢測中的一大挑戰。臨床樣本中的EV 是一種目標和非目標EV 的混合物，不同分離技術得到的EV 不盡相同，也很難說哪種方法是最佳選擇[36]。此外，很難從生物體液中分離出純粹的EV，干擾物會影響樣品純度。因此，需要綜合考慮產量、純度和分離效率來選取最適合的EV 分離和表征方法。Tzaridis 等[37]建議將尺寸排阻色譜與超速離心相結合作為人血漿或血清生物標志物研究的首選EV分離方法。Van 等[38]報告了一種“雙模式色譜”的新分離方法通過去除脂蛋白來提高EV 蛋白分析的準確性。5.2 EV 的高度異質性 從癌癥中釋放的EV 在大小、表面蛋白和其他成分方面都是異質的，即便是從同一細胞釋放的EV 亞型也具有多樣性[39]。應用單囊泡分析的單EV 研究是目前的最新研究方向，單囊泡檢測可進一步明確單個EV 的特征。單EV 的功能及特性尚未完全明確，其較強的異質性可能源于EV 生物發生的隨機機制[40]。Kim 等[41]使用基于“EV-Ident”的單囊泡分析方法來了解EV 異質性，并成功鑒定出PCa EV 的三種不同尺寸亞型。

6 總結與展望

早期診斷泌尿系腫瘤是提高患者生存率和預后的關鍵因素。目前以單囊泡分析為代表的新興檢測和分析方法在不斷揭示EV 的內在特征，大量可能用于診斷泌尿系腫瘤的EV 生物標志物也在不斷涌現，鑒于EV 在臨床方面的巨大潛力，EV 用于診斷泌尿系腫瘤或許并不遙遠。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突