1 317例高危孕婦胎兒產前分子細胞遺傳學分析

馬麗爽 霍平 張萍萍 楚偉 王向靜 高健

胎兒染色體核型分析作為產前診斷胎兒染色體異常的經典細胞遺傳學方法,可檢出染色體數目和結構異常,但對小于5 Mb的拷貝數變異(copy number variations,CNVs)卻無法識別,而CNVs是許多發育障礙的重要遺傳原因[1],染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)中的單核苷酸多態性微陣列技術(single nucleotide polymorphism array, SNP-Array)已被認為是智障或多種先天性異常患者的首選檢測方案[2],其不僅能識別非整倍體、三倍體和單親二倍體,還能識別小于5 Mb的CNVs,但其對染色體結構異常和低比例嵌合卻不及核型分析能穩定檢出[3],SNP-Array技術可補充核型分析,提高了胎兒染色體異常檢出率,對于預防和控制出生缺陷是有效的[4-5]。本文回顧性分析1 317例具有產前診斷指征的高危孕婦胎兒行G顯帶核型分析聯合SNP-Array技術,分析其染色體結果及妊娠結局,以探討其診斷價值。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析2018年8月至2020年5月因具有高齡、血清學篩查高風險、不良孕史、超聲異常、夫婦染色體異常等產前診斷指征的1 317例高危孕婦,血清學篩查分為無創產前檢測和唐氏綜合癥產前篩查,超聲異常分為超聲軟指標陽性、超聲結構異常、生長受限和羊水量異常,超聲軟指標包括腦室擴張、顱后窩池擴張、脈絡叢囊腫、頸部透明層(nuchal translucency, NT)、頸后皮膚皺褶(nuchal fold, NF)、鼻骨發育不良、小腦發育不良、心內強回聲灶、強回聲腸管、胸腔積液、輕度腎盂擴張、膽囊增大、胃泡顯示不清或偏小、長骨短、單臍動脈、臍帶囊腫[6]。為排除其他指標干擾,特研究孤立性指標,以探討其臨床價值。孕婦及家屬簽署知情同意書后行介入性產前診斷穿刺術,取羊水或臍帶血行SNP-array檢測和G顯帶核型分析,孕婦年齡17～48周歲,平均(30.5±5.5)周歲;孕周17～34周,平均(22.7±4.5)周。

二、方法

1.介入性產前診斷穿刺術:因高齡、血清學高危、超聲異常、不良孕史、夫婦染色體異常等之一或多項產前診斷指征的孕婦均行核型及SNP-array檢測,孕17～24周行羊膜腔穿刺術,取羊水20 mL行G顯帶核型分析,10 mL行SNP-array檢測;孕25周以后孕婦行臍帶血穿刺術1 mL行G顯帶核型分析,0.5 mL行SNP-array檢測。

2.G顯帶核型分析:常規37℃培養箱培養羊水5～6 d換液、隔天觀察、擇時收獲、制片、G顯帶;37℃培養箱培養臍帶血72 h、收獲、制片、G顯帶,核型分析依據2016年染色體核型分析命名體制(International System for Human Cytogenetic Nomenclature, ISCN),常規細胞計數20個,如為嵌合核型計數100個,分析5個分散良好的染色體核型。核型異常指染色體數目或結構異常,不含多態性。

3.SNP-array檢測:采用Affymetrix Cytoscan 750K Array(美國Affymetrix公司)進行全基因組芯片檢測,提取DNA、片段化、標記信號、雜交及掃描,芯片儀讀取數據應用ChAS4.0軟件分析結果。依據CNVs位置、大小、DGV數據庫、ISCA數據庫、Decipher數據庫、Clingen數據庫報道等將結果分為致病性變異、可能致病變異、臨床意義不明、可能良性變異、良性變異。SNP-Array異常指致病性變異、可能致病性變異、臨床意義不明。

4.妊娠結局的隨訪:對所有孕婦分娩后4～6個月進行電話隨訪,了解妊娠結局和新生兒生長發育情況,針對染色體異常而選擇分娩的嬰兒于1歲左右進行追蹤隨訪。

5.統計學處理:應用SPSS21.0統計軟件,組間比較采用卡方檢驗、Fisher確切概率法,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、核型與SNP-Array檢測結果

在1 317例胎兒染色體中,核型多態性44例(3.3%,44/1 317),核型異常152例(152/1 317,11.5%),SNP-Array異常241例(241/1 317,18.3%),兩種檢測比較,差異有統計學意義。152例核型異常中21-三體42例、18-三體10例(包括1例超雌)、13-三體3例、特納12例、超雌12例(包括1例18-三體)、克氏17例、超雄10例、48,XXYY 1例、易位22例(包括1例倒位)、增加6例、缺失5例、衍生4例、倒位3例(包括1例易位)、額外標記染色體2例、重復1例、插入1例、其他2例。241例SNP-Array檢測異常中致病性變異146例、可能致病性變異42例、臨床意義不明53例,其中重復56例(片段206～82 900 kb)、缺失79例(片段104～53 900 kb)、雜合性丟失18例(片段3 100～32 630 kb)。

核型異常152例(152/1 317,11.5%),SNP-Array異常241例(241/1 317,18.3%)。兩種檢測聯合應用染色體異常270例(270/1 317,20.5%),與核型異常檢出率比較,差異有統計學意義。

核型與SNP-Array均異常123例(123/1 317,9.3%),其中致病性變異109例、可能致病性變異12例、臨床意義不明2例,其中重復11例(片段3 420～82 900 kb),缺失18例(片段725～53 900 kb);核型正常中SNP-Array異常110例(110/1 121,9.8%),其中致病性變異35例、可能致病性變異28例、臨床意義不明47例,其中重復42例(片段206～23 300 kb),缺失55例(片段104～12 070 kb),雜合性丟失18例(片段3 100～32 630 kb);SNP-Array正常中核型異常31例(31/1 076,2.9%),其中小于5%低比例嵌合3例,額外標記染色體1例,附加、易位、倒位、衍生、插入等27例。

二、核型與SNP-Array結果不符情況

1 121例核型正常胎兒中SNP-Array異常110例;1 076例SNP-Array正常胎兒中核型異常31例;123例兩種檢測均異常胎兒中結果不符4例,病例1核型為45,XN,der(13;14)(q10;q10),SNP-Array結果為1q21.1q21.2缺失;病例2核型為46,XN,13q?,SNP-Array結果為22q11.21q11.21缺失1.084Mb;病例3核型為46,XN,add(8)(p23)pat,SNP-Array結果為8p23.3p23.1缺失8.68Mb,足月順產,隨訪至11個月發育未見異常;病例4核型為46,XN,add(21)(p13),SNP-Array結果為22q13.1q13.33重復。產前診斷指征與核型、CNVs相關性。

剔除其他高危因素,孤立性產前診斷指標中無創高危組核型與SNP-Array異常率最高。合并兩類指標中,高齡僅合并無創高危組的胎兒核型及SNP-Array異常率最高。見表1。

表1 產前診斷指征與核型、CNVs相關性分析[例(%)]

三、孕齡與核型、CNVs相關性

依據孕婦年齡分組,相關分析顯示,21-三體發生率與年齡之間Pearson相關性(系數=0.901),顯著性(雙側,系數=0.037)。進一步采用一元線性回歸分析,年齡為自變量,21-三體發生率為因變量,系數=0.950,R2=0.902,F=37.007,P=0.004,說明21-三體發生率與年齡呈正相關,但年齡分組中CNVs與年齡沒有相關性,見表2。

四、不良孕史與核型、CNVs相關性

剔除其他高危因素,將不良孕史分為21-三體生育史、胎停育史和其他組,孤立性胎停育史組的胎兒核型異常率最高,其他不良孕史合并超聲軟指標陽性組SNP-Array異常率最高,孤立性21-三體生育史組的胎兒未檢出染色體異常,見表3。

表3 不良孕史與核型、CNVs相關性分析[例(%)]

五、超聲軟指標類型及超聲異常數目與核型、CNVs相關性

在孤立性超聲軟指標陽性組中,SNP-Array共檢出24例染色體異常,其中致病性變異共9例,為5例21-三體,1例18-三體,1例Y與X染色體比例異常(嵌合比例30%),1例Xq28重復和1例22q13.1q13.33重復;可能致病性變異7例,臨床意義不明8例。

剔除其他高危因素,在孤立性超聲軟指標陽性分組中,核型分析僅孤立性心內強回聲灶的胎兒檢出染色體異常[46,XN,ins(13;4)(q22;q31q35)],SNP-Array檢測孤立性長骨短的胎兒染色體異常率最高,其次依次是孤立性NF增厚、孤立性側腦室擴張。剔除其他高危因素,僅超聲異常組中隨超聲異常數目增加,核型和SNP-Array染色體異常率隨之升高,差異有統計學意義,見表4。

表4 超聲軟指標類型及超聲異常數目與核型、CNVs相關性分析[例(%)]

六、12例胎兒SNP-Array異常父母驗證結果及妊娠結局

父母驗證的SNP-Array異常胎兒中7例來源于父母,父母表型均正常,其中1例因足內翻選擇終止妊娠,其他均順利分娩,隨訪至1周歲左右發育未見異常。另外5例SNP-Array異常胎兒為新發變異,其中1例胎兒核型及FISH均正常,SNP-Array為可能致病性變異,父母驗證SNP-Array均正常,臨床遺傳咨詢后選擇繼續妊娠后順利分娩,隨訪至1歲6個月,發育未見異常,其他4例均選擇終止妊娠。

討 論

單核苷酸多態性是指基因組中DNA某一特定核苷酸位置上發生轉換、顛換、插入或缺失等變化,而且任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1%[7]。CMA是一種以微陣列為技術基礎的高分辨率全基因組染色體變異檢測技術,近年來在臨床已廣泛應用。相比于基于微陣列的比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)和低深度全基因組測序(CNV-seq)技術,SNP-Array技術對于染色體非整倍體和拷貝數變異的檢測與aCGH和CNV-seq技術相當,但對于單親二倍體、三倍體和一定比例嵌合體的檢測優勢更為突出,而且CNV-seq測序深度低有可能會漏檢,SNP-Array以高分辨率、高準確性的優點,與傳統核型分析聯合應用可以更好地指導臨床遺傳咨詢[8]。

任何單一的產前診斷檢測方法均有漏檢或誤檢的可能,本研究中,SNP-Array的異常檢出率(18.3%)相比核型分析的異常檢出率(11.5%)提高了26.8%,兩者聯合應用的染色體異常檢出率達到20.5%。若僅行核型分析而不進行SNP-Array檢測,其染色體異常漏檢率達9.8%,包括致病性變異35例,可能致病28例。而若僅行SNP-Array檢測而不進行核型分析,其染色體異常漏檢率達2.9%,包括小于5%低比例嵌合3例,額外標記染色體1例,附加、易位、倒位、衍生、插入等27例,需結合SNP-Array結果方能進行更精準的遺傳咨詢,若SNP-Array沒有致病性CNVs,可以考慮繼續妊娠。123例兩種檢測均異常胎兒中結果不符4例,其中1例核型示46,XN,add(8)(p23)pat,SNP-Array示8p23.3p23.1缺失8.68 Mb,由此分析核型提示8號染色體增加未知起源遺傳物質,有可能是多態性變異,因沒有引起拷貝數變異,故SNP-Array無法識別,但檢出8號染色體p23.3p23.1區段存在約8.68 Mb的缺失,根據DGV、ISCA、Decipher與Clingen數據庫綜合分析,該片段為可能致病性變異[9],經SNP-Array夫婦驗證,缺失片段來源于父親,但父親表型正常,經過深度遺傳咨詢,夫婦決定保留胎兒,該嬰兒足月順產,出生后6個月及11個月隨訪嬰兒身體及智力發育均未見異常。另1例核型示46,XN,13q?,SNP-Array示22q11.21微缺失,由此分析核型提示13號染色體長臂可疑異常,也有可能是多態性變異,沒有引起拷貝數變異,故SNP-Array未檢出,而SNP-Array提示22號染色體缺失1.084 Mb,可能致病性變異,核型未檢出,也補充了結果,建議夫婦驗證,但孕婦及家屬選擇終止妊娠未驗證。而另1例核型示46,XN,add(21)(p13),SNP-Array示22q13.1q13.33微重復,由此分析是22號染色體微重復的部分到了21號染色體。由此可見,SNP-Array技術較核型分析染色體異常檢出率高,兩者聯合應用可彌補各自不足,提高染色體異常檢出率,核型結果與SNP-Array結果相互補充,可以更精準的分析染色體異常,有利于臨床咨詢及再生育指導[10-11]。

剔除其他高危因素,本研究中,探討孤立性產前診斷指標對胎兒染色體的影響,其中孤立性無創高危組核型與SNP-Array異常率最高,尤其SNP-Array可檢出核型不可識別的CNVs,可見,核型聯合SNP-Array在無創高危孕婦的產前診斷中體現出較高的臨床應用價值[12-13]。在年齡分組中,21-三體發生率與年齡呈正相關,而孤立性高齡組SNP-Array檢測致病性變異檢出率僅為1.6%,年齡分組中CNVs與年齡沒有相關性,可見SNP-Array檢測應涉及到所有年齡段的高危孕婦[14]。

在孤立性不良孕史中,孤立性胎停育史組的胎兒核型異常率最高,其他不良孕史合并超聲軟指標陽性組SNP-Array異常率最高,而染色體異常是胎停育的最常見原因,具有胎停育史的孕婦其胎兒再次患染色體異常的發生率仍較高[15-17]。而孤立性21-三體生育史組的胎兒未檢出染色體異常,因剔除其他高危因素,可能與樣本量較少有關,還需擴大樣本量進一步研究。

在孤立性超聲軟指標陽性組中,SNP-Array共檢出24例染色體異常,其中致病性變異共9例,為5例21-三體,1例18-三體,1例Y與X染色體比例異常(嵌合比例30%),1例Xq28重復和1例22q13.1q13.33重復;可能致病性變異7例,臨床意義不明8例。在超聲軟指標分組中,核型分析僅孤立性心內強回聲灶的胎兒檢出染色體異常,為46,XN,ins(13;4)(q22;q31q35),可見心內強回聲灶仍不排除染色體異常可能。其他孤立性超聲軟指標核型分析沒有檢出染色體異常,但SNP-Array卻能檢出CNVs,其中SNP-Array檢測孤立性長骨短的胎兒染色體異常率最高,其次依次是孤立性NF增厚、孤立性側腦室擴張,且隨超聲異常數目增加,核型和SNP-Array染色體異常率隨之升高。早在2013年CMA就已經被美國婦產科醫師學會和母胎醫學協會推薦作為超聲結構畸形胎兒的首選技術應用于產前診斷,可見,超聲異常尤其是超聲軟指標陽性的胎兒其染色體異常的發生率較高,傳統核型分析存在局限性,SNP-Array檢測已成為超聲異常胎兒產前診斷首選一級檢測方案[18-19],而SNP-Array檢測異常后應父母加以驗證,但因SNP-Array費用較高,無法普及。本研究中父母SNP-Array驗證的異常胎兒中7例來源于父母,父母表型均正常,其中1例因足內翻選擇終止妊娠,其他均順利分娩,隨訪至1周歲左右發育未見異常。另外5例SNP-Array異常胎兒為新發變異,其中1例胎兒核型及FISH均正常,SNP-Array為可能致病性變異,父母驗證SNP-Array均正常,臨床遺傳咨詢后選擇繼續妊娠后順利分娩,隨訪至1周6個月,發育未見異常,其他4例均選擇終止妊娠。可見,染色體異常胎兒應雙親驗證并結合進一步連續超聲檢查及遺傳咨詢,以指導孕婦是否繼續妊娠。

綜上所述,21-三體發生率與年齡呈正相關,無創高危、胎停育史、長骨短、NF增厚和側腦室擴張提示染色體異常風險升高,心內強回聲灶仍不排除染色體異常的可能,遺傳咨詢中雙親驗證后的家系綜合分析仍十分重要,核型分析聯合SNP-Array技術可提高染色體異常檢出率,核型結果與SNP-Array結果相互補充,可以更精準的分析染色體異常,有利于遺傳咨詢及再生育指導,是高危孕婦胎兒首選的產前診斷方案。