野生稻單片段代換系芽期耐旱性評價及QTLs鑒定

黃秀艷,栗俊波,廖 冰,傅雪琳,何 平

(1.華南農業大學生命科學學院,廣東 廣州 510642;2.華南農業大學農學院,廣東 廣州 510642)

水稻是我國主要的糧食作物,而水資源短缺是目前影響水稻生產的重要因素之一。干旱嚴重影響水稻植株的生長發育,導致其產量及品質下降[1]。水稻的抗旱性是復雜的、多基因控制的數量性狀,植物通過調控自身生長發育及調節體內相關物質含量來應對干旱環境。當受到干旱脅迫時,植物的根、葉形態發生改變,主要表現為葉片卷曲、枯黃和生長延緩等,根系的形態建成也會受到影響,脅迫嚴重時可導致植株死亡[2-3];此外,受到干旱脅迫時,植物體細胞會產生大量的O2-和H2O2,細胞膜結構遭到破壞,植物通過調節可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量等滲透物質來抵抗干旱脅迫[4]。

聚乙二醇(PEG)作為常見的滲透調節劑,被廣泛用于篩選抗旱指標和鑒定作物的抗旱性[5-8]。目前,采用PEG模擬干旱環境進行作物種子抗旱性等方面的研究有較多報道。Wang等[9]利用20% PEG-6000溶液對雜草稻和栽培稻品種進行了耐旱發芽試驗。Binodh等[10]利用不同濃度的PEG溶液對85個傳統水稻地方品種和15個改良品種及1個耐旱(IR 64 Drt1)與旱敏感(IR 64)材料種子萌發過程中的水分脅迫耐受力進行評估發現,種子萌發受PEG脅迫的影響很大,在脅迫下出現根和芽長度顯著縮短的現象,PEG引起的水分脅迫降低了萌發種子的滲透勢。馮舉伶等[11]為研究春小麥的萌發期耐旱性,利用20% PEG-6000的滲透脅迫性,從119份春小麥資源中篩選出了2份耐旱性較好的材料。李靜靜等[12]為研究小麥的萌發期耐旱性,利用20% PEG-6000溶液對不同材料進行滲透脅迫,并通過主成分分析和綜合評價值法對20份小麥進行抗旱性綜合評價,篩選出‘晉麥47’、‘運旱618’、‘長治6406’、‘石4185’和‘旱選10號’等抗旱性較強的品種。

野生稻種通常能更好地適應不同的生態環境,并能耐受許多生物和非生物脅迫,本研究的供試材料為單片段代換系(Single chromosome segments substitution lines,SSSLs),這些SSSLs上攜帶有供體野生稻的基因片段,其中可能含有豐富的新基因。在水稻芽期利用濃度為20%的PEG-6000脅迫劑模擬干旱環境,對60份SSSLs及其受體‘華粳秈74’(‘HJX74’)萌發期抗旱相關性狀進行測定和QTL鑒定分析,以擴充水稻耐旱種質資源,獲得新的優異基因,為水稻耐旱育種提供參考和指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020—2021年在華南農業大學生命科學學院實驗室光照培養箱進行,供試材料為以‘華粳秈74’(‘HJX74’)為受體親本、分別以展穎野生稻和南方野生稻為供體親本構建的60份單片段代換系(SSSLs),其中包括15份編號為X開頭的展穎野生稻SSSLs,45份編號為M開頭的南方野生稻SSSLs,均由華南農業大學農學院傅雪琳教授提供。

1.2 種子發芽與處理方法

發芽與處理采用培養皿發芽試驗法進行。每個材料選取成熟、飽滿且均勻一致的健康種子150粒,置于45℃恒溫干燥箱烘種5 d以打破種子休眠,將種子用75%酒精浸泡30 s后,倒去酒精溶液,用蒸餾水清洗3～4遍,濾紙吸干種子表面水分,置于直徑7.5 cm的培養皿中,標記材料編號。每個培養皿內放置20粒種子,加入20 mL蒸餾水進行浸種,待種子破胸露白后,將其轉移到墊有兩層無菌濾紙的培養皿中,其中對照組每皿加10 mL蒸餾水,處理組每皿加10 mL 20% PEG-6000溶液,1個培養皿為1次重復,每個處理設3次重復。在發芽過程中,每天更換20% PEG-6000和蒸餾水。將培養皿置于光照培養箱(28℃;12 h光照,光強18 000 Lux,12 h黑暗)培養至第8天,從每個培養皿中隨機挑取10 粒發芽種子測量芽長、根數、胚芽鞘長、根長;將剪取的根和芽分別放置在105℃的鼓風干燥箱中殺青1 h,80℃烘干至恒重,稱量根干質量及芽干質量。以各性狀的相對值(處理與對照的比值)作為評價指標,包括相對根長(Relative root length,RRL)、相對芽長(Relative shoot length,RSL)、相對根數(Relative root number,RRN)、相對胚芽鞘長(Relative coleoptile length,RCL)、相對芽干質量(Relative shoot dry weight,RSDW)以及相對根干質量(Relative root dry weight,RRDW)。

1.3 SSSLs耐旱性評價方法

SSSLs耐旱性綜合評價采用隸屬函數值法,參考段永紅等[13]的方法,計算公式如下:

U(Xij)=(Xij-Xijmin)/(Xijmax-Xijmin)

(1)

Xi=∑U(Xij)/n

(2)

式中,U(Xij)表示i材料j指標的隸屬函數值,Xij表示i材料j指標的測定值,Xijmin表示第j個指標在所有供試材料中的最小測定值,Xijmax表示第j個指標在所有供試材料中的最大值;n為測定指標個數,Xi表示i材料n個指標的平均隸屬函數值(Mean membership function values,MMFV),Xi值大小與材料耐旱性呈正相關關系。

1.4 耐旱SSSLs QTL鑒定

在P<0.01水平,將供試材料的性狀指標值進行單因素方差分析及Duncan’s多重比較,再結合各SSSLs平均隸屬函數值大小,篩選出性狀值顯著高于‘HJX74’的SSSLs,以這些SSSLs的各項指標進行耐旱性QTL鑒定。對有重疊片段的SSSLs通過代換作圖的方法確定QTL所在區間。QTL的命名參考Mccouch等[14]的命名原則。參考Eshed等[15]的方法計算QTL的加性效應及表型貢獻率:

加性效應=(SSSL表型值-‘HJX74’表型值)/2

加性效應表型貢獻率(%)=(加性效應/‘HJX74’表型值)×100%

1.5 數據處理

需要分析的數據取各指標的相對值,以降低試驗材料的基礎差異[16]。數據采用Excel 2016整理及作圖,利用SPSS 26.0軟件進行相關性分析和單因素方差分析(One-way ANOVA),多重比較采用Duncan’s字母標記法,QTL在染色體上的分布圖用Mapchart 2.3軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 SSSLs群體及受體‘HJX74’芽期耐旱指標相對值的變化

20% PEG-6000處理條件下水稻SSSLs芽期6個耐旱指標的相對值頻次分布顯示(圖1),干旱脅迫處理后的6個相關性狀在SSSLs之間存在遺傳差異,均呈現出顯著的正態分布特點,變異幅度較大,其中相對芽長的分布范圍為0.36～0.80,相對根長的分布范圍為0.20～1.15,相對胚芽鞘長的分布范圍為0.70～1.38,相對根數的分布范圍為0.35～1.15,相對根干質量的分布范圍為0.20～0.80,相對芽干質量的分布范圍為0.25～0.65。

2.2 耐旱指標相對值與平均隸屬函數值相關性分析

通過對60個SSSLs及受體‘HJX74’在20% PEG-6000處理條件下的6個耐旱指標(相對芽長、相對根長、相對胚芽鞘長、相對根數、相對根干質量、相對芽干質量)與平均隸屬函數值進行相關性分析(表1)可知,相對芽長與相對根數、相對芽干質量極顯著正相關(P<0.01),與相對根干質量顯著正相關(P<0.05),表明芽長生長與根數量、地上部分和地下部分的干物質積累有密切關系,均能作為水稻芽期耐旱性鑒定和評價指標。相對根長與相對根數、相對根干質量極顯著正相關(P<0.01),與相對胚芽鞘長顯著正相關(P<0.05),表明根的生長主要受根系數量和干物質積累的影響。相對根數與相對根干質量極顯著正相關(P<0.01),表明根系數量的形成與根部干物質積累有關。相對根干質量與相對芽干質量顯著正相關(P<0.05)。平均隸屬函數值與各指標均呈極顯著正相關關系,可作為水稻芽期耐旱性鑒定和評價指標。

2.3 隸屬函數法綜合指標分析

平均隸屬函數值能綜合反映各性狀指標受干旱影響的程度,平均值越大表明其受干旱影響越小,說明品種的抗旱性越強。通過對60個SSSLs與受體‘HJX74’的平均隸屬函數值進行比較,最終確定其抗旱性的強弱排序。如表2所示,平均隸屬函數值大于0.60的SSSLs有8個,其耐旱能力較強;平均隸屬函數值為0.50～0.60的SSSLs有29個,其耐旱能力中等;平均隸屬函數值小于0.50的SSSLs有24個,其耐旱能力較弱。受體‘HJX74’平均隸屬函數值為0.58,介于0.50～0.60,其耐旱脅迫能力中等;平均隸屬函數值最大的材料是X8,達0.71,說明其抗旱性較強;平均隸屬函數值最小的材料是M113,為0.14,說明其抗旱性最弱。

2.4 耐旱性SSSLs篩選及QTL鑒定

2.4.1 耐旱性SSSLs的QTL鑒定材料篩選 以SSSLs單個性狀指標相對值與‘HJX74’的相對值進行單因素方差分析及多重比較,在P<0.01水平,篩選出與‘HJX74’性狀值差異顯著的SSSLs,用于QTL鑒定。若其中某個SSSL的某性狀相對值顯著大于‘HJX74’,則認為該SSSL材料以該性狀為指標表現出耐旱特性,其代換片段上攜帶相應的耐旱性QTL。

在P<0.01水平、20% PEG-6000溶液處理條件下,以各SSSLs的6個指標相對值進行單因素方差分析及多重比較發現,供試SSSLs種子發芽第8天的相對芽長、相對根數與‘HJX74’存在顯著差異,其余4個指標的相對值分析結果無顯著差異,因此選擇相對芽長與相對根數指標作為耐旱QTL鑒定材料的篩選指標。以相對芽長為性狀指標時,X24、X8材料的芽長顯著高于‘HJX74’,表明這2個材料的耐旱性較強;以相對根數為性狀指標時,M77、M120、M133、M142材料的總根數顯著多于‘HJX74’,表明這4個材料的耐旱性較強(圖2)。由表2可知,相對芽長耐旱SSSLs中,X24、X8的平均隸屬函數值分別為0.65、0.71,在總材料中分列第6和第1;相對根數耐旱SSSLs中,M77、M120、M133、M142材料的平均隸屬函數值分別為0.66、0.67、0.56和0.55,在總材料中分列第5、第4、第20和第23。所有材料的綜合排名均較靠前,說明根據各材料相對芽長與相對根數可以篩選出耐旱SSSLs。

2.4.2 相對芽長QTLs鑒定及其遺傳效應 利用代換作圖法對含有重疊片段的不同SSSLs進行QTL定位,SSSLs遺傳效應方向一致,則認為該重疊片段存在QTL,若其中一個SSSL中檢測到QTL,另一個未檢測到,則認為置換片段的非重疊片段上存在QTL。根據SSSLs QTL鑒定原理,以相對芽長作為耐旱指標進行QTL鑒定,X24、X8材料的單片段在1號染色體上存在重疊片段RM490-RM572(圖3A),認為這2份SSSLs的代換片段上攜帶有來自展穎野生稻的耐旱QTL;該區間可能存在一個共同的QTL,為qRSL1-1(圖4A);單片段材料X24、X8的QTL的加性效應分別為0.07和0.08,表型貢獻率分別為11.17%和13.85%(表3)。

表1 SSSLs芽期各耐旱指標間及其與平均隸屬函數值間的相關系數

表2 不同SSSLs在PEG脅迫下耐旱指標的隸屬函數值與平均隸屬函數值綜合結果

2.4.3 相對根數QTLs鑒定及其遺傳效應 以相對根數作為耐旱指標進行QTL鑒定,M77、M120材料的單片段在10號染色體上存在重疊片段PSM406-PSM164(圖3B),認為這2份SSSLs的代換片段上攜帶有來自南方野生稻的耐旱QTL,該區間可能存在一個共同的QTL,為qRRN10-1(圖4B)。單片段材料M77、M120的QTL加性效應分別為0.24、0.17,表型貢獻率分別為36.34%、25.03%;M133、M142材料分別攜帶來自11號和12號染色體耐旱QTL,分別為qRRN11-1和qRRN12-1(圖3C、3D,圖4C、4D),加性效應分別為0.16、0.11,表型貢獻率分別為23.59%、16.64%(表3)。

注:* 表示供試材料的相關性狀值與‘HJX74’在P<0.01水平差異顯著。

圖3 耐旱SSSLs中QTLs的替換圖譜

表3 PEG處理條件下耐旱SSSLs的相對芽長及相對根數QTLs及其遺傳效應

3 討論與結論

干旱是作物生長及其產量增加的重要限制因素,因此進行抗旱品系篩選與研究具有重要意義[17]。Han等[18]利用20% PEG-6000模擬干旱條件,發現水稻發芽期第6天根長、根數、苗高和胚芽鞘長等指標均受到干旱脅迫條件的抑制。Li等[19]研究表明在15% PEG誘導的干旱脅迫下,旱稻‘IRAT109’和低地水稻‘Yuefu’兩品種的種子發芽勢、幼苗根長和芽長均顯著降低。熊雪等[20]利用20% PEG-6000模擬干旱環境,采用隸屬函數法對相對發芽勢、相對發芽率、相對胚根長、相對胚芽長、相對鮮質量及抗旱指數等指標進行耐旱性分析,采用綜合指標對21份谷子材料進行耐旱性綜合評價,篩選出抗旱性最強的品種為‘承谷9’。本研究以平均隸屬函數值作為水稻SSSLs芽期耐旱性標準來評價各SSSLs的耐旱性,發現各SSSLs在20% PEG-6000模擬干旱條件下的芽長、根長、胚芽鞘長、根數、干物質量等指標均受到一定程度的影響,不同基因型水稻對干旱脅迫的反應有所不同,且不同材料評價指標代表的耐旱能力也不完全相同,這與熊雪等[20]研究結果較為一致。田敬園[21]利用土壤干旱法探究抗旱復合劑對谷子幼苗生長發育的影響,發現抗旱復合劑處理組的谷子幼苗根長和芽長受到的影響較小,而未處理組谷子幼苗根長和芽長顯著減小。Yamane等[22]采用育苗盤對5個水稻品種進行干旱脅迫處理,結果表明耐旱性強的水稻品種芽長較長、種子干物質重較低。本研究在20% PEG-6000模擬干旱條件下,以相對芽長為耐旱指標時,篩選出2個SSSLs的相對芽長顯著高于受體‘HJX74’,表明芽長可作為耐旱性的評價指標。綜上可知,利用高滲溶液進行干旱脅迫處理的效果與土壤干旱相似,能夠起到模擬干旱脅迫的作用。前人對于水稻耐旱性的評價多采用單一指標,無法全面有效評價品種的耐旱性,本研究選用20% PEG-6000模擬干旱條件下與耐旱性相關的6個指標,以平均隸屬函數值為標準,通過單因素方差分析及多重比較得出相對芽長、相對根數可作為SSSLs芽期耐旱性QTL鑒定的指標,以這兩個指標對SSSLs 進行耐旱QTL的初步鑒定,結果更為可靠。

水稻干旱基因調控機制非常復雜,應對干旱的效應QTL在不同時期發揮的作用可能不同,有些效應QTL在特定的時期才會發揮作用被檢測出來[23-24]。關于水稻苗期相關性狀定位有較多報道,主要集中在對水稻的胚芽鞘長、胚根長、根表面積、體積等方面進行遺傳分析與QTL定位。王嬌[25]以雜交組合構建重組自交系為試驗材料,在20% PEG-6000模擬干旱條件下檢測到發芽勢與苗高有關的QTLqGV3-2和Qsh5-2,表型貢獻率分別為14.98%和15.61%。田彪等[26]利用秈稻‘9311’和粳稻‘日本晴’(Nipponbare,NPB)為親本構建的148個重組自交系群體為材料,共檢測到26個控制最長根長、總根系長、根表面積、根體積和根直徑的QTLs;其中在第4號染色體上檢測到控制最長根長的QTLqLRL4,利用InDel標記在IND4-1和IND4-3之間將其精細定位,長約68.23 kb。姜雪[27]以‘珍汕97 B’(‘ZS97B’)和‘IRAT109’構建的重組自交系RIL為試驗材料,利用18% PEG-6000模擬干旱條件在水稻苗期開展耐旱QTL定位試驗,脅迫處理條件下共檢測到26個生理生化相關的QTLs,其中在1號染色體RM220-RM490區間檢測到過氧化氫(H2O2)相關位點,該區間包含在本研究鑒定的相對芽長QTLqRSL1-1的區間RM490-RM572,表明水稻1號染色體該區間存在與植株地上部耐旱相關的QTL;同時在10號染色體RM216-RM311區間檢測到總抗氧化能力(AOC)和過氧化氫(H2O2)相關位點,3個相鄰區間RM222-RM216、RM311-RM467和RM216-RM311定位到2個丙二醛(MDA)和1個總抗氧化能力(AOC)相關位點,其中包含本研究鑒定的相對根數QTLqRRN10-1的區間RM406-PSM164,表明水稻10號染色體該區間存在與植株地下部耐旱相關的QTL。徐穎[28]利用導入系群體進行水稻耐旱性QTL定位,在每穗總粒數、千粒重性狀定位到抗旱QTL,均位于11號染色體的RM260位置,包含在本研究鑒定的相對根數QTLqRRN11-1的區間RM202-PSM415內,表明水稻11號染色體該區間存在與水稻耐旱相關的QTL。王江旭[29]對水稻劍葉面積、凈光合速率進行多環境聯合分析,在12號染色體的RM1300-RM1310區間定位到耐旱加性QTL,同時株高在該區間也檢測到QTL,包含在本研究鑒定的相對根數QTLqRRN12-1的區間PSM465-PSM193內。Xu等[30]在不同年份干旱處理條件下定位到株高、穗長QTLs,分別為qPHP-12和qPL-12-1,依次位于12號染色體的RM2529-RM1337區間和RM270-RM3455區間,均包含在本研究鑒定的相對根數QTLqRRN12-1的區間PSM465-PSM193內,表明水稻12號染色體該區間存在控制耐旱性狀的數量基因簇。

本研究以構建的單片段代換系為供試材料,極大地減少了遺傳背景的干擾,通過20% PEG-6000溶液模擬干旱條件,在水稻抗旱性評價重要時期芽期進行耐旱指標篩選及耐旱性鑒定,采用的平均隸屬函數值能綜合反映各性狀指標受干旱影響的程度;篩選出相對芽長、相對根數作為耐旱QTL鑒定材料的指標,在這2個指標上共鑒定到4個耐旱QTLs,這些QTLs均表現出正的加性效應,同時篩選出了耐旱性較強的SSSLs。此外,試驗在室內開展,操作方法簡便,結果可靠性強。今后可將篩選出的芽期耐旱材料進一步應用于苗期及大田試驗,為探索作物耐旱機制、篩選和培育水稻耐旱品系提供參考和指導。