一株淡紫紫孢菌對聚乙烯地膜降解能力的研究

王 蕾,惠向娟,支 慧,上官周平,李 瑋

(1. 青海大學農林科學院,青海 西寧 810016;2. 農業農村部西寧作物有害生物科學觀測實驗站,青海 西寧 810016;3. 青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室,青海 西寧 810016)

我國于20世紀70年代引進農田地膜覆蓋技術,該技術已經普遍用于農作物栽培,特別是在北方干旱地區獲得廣泛應用。近年來,隨著糧、棉、油料等作物產量的增加,農用地膜使用量也在年年攀升。地膜覆蓋面積從1982年的7 804 hm2增加到2015年的1 834萬hm2。預計到2024年,我國農用地膜使用量將達到200萬 t,覆蓋土地面積將達到2 211萬 hm2[1]。研究表明我國西北地區地膜殘留量最多,尤其是在新疆、甘肅,平均地膜殘留量分別高達259.1 kg·hm-2和136.7 kg·hm-2[2]。監測數據顯示,新疆喀什地區農田廢棄地膜殘留量約65.7～236.7 kg·hm-2,個別地塊的最高殘留量達519.3 kg·hm-2,是全國平均水平的3～5倍[3]。青海省地膜使用的歷史較東、中部省區要短,據青海省農牧廳統計,截止2018年青海省全膜雙壟技術推廣達到1.1萬 hm2,主要應用于馬鈴薯、白菜和辣椒等作物[4-5]。不同顏色地膜覆蓋透光性不同,對土壤保溫性和保水性不同,對作物產量的影響也不同[6]。青海屬于高海拔地區,紫外線強烈,生產中多使用白色透明地膜。黑色與白色透明雙色地膜覆蓋技術有維持土壤溫度、抑制膜下雜草生長等優點,該技術的投入生產和使用使土壤中地膜殘留種類增加,更加難以回收與降解[7]。目前實際農業生產中仍以聚乙烯或聚氯乙烯為原料的塑料薄膜應用更加廣泛,此類薄膜成分為高分子化合物,分子結構穩定,在自然界中很難被光和熱降解;加之地膜越來越薄且容易破碎,導致回收工作難度大大增加。隨著地膜使用年限的延長,殘留在土壤中的地膜得不到及時回收,殘膜量不斷累積,造成土壤肥力下降,影響農作物根系生長發育;此外,殘膜經過耕作、風力、生物等作用降解形成微塑料顆粒[8-12],對農田土壤環境造成嚴重污染,不利于農業可持續發展。

近年來,生物降解地膜逐漸開始在實際生產中應用推廣,這類地膜一定程度上減輕了聚乙烯地膜對農田的危害,但其存在成本高、降解過程復雜等缺點,且對土壤生態系統的長期影響具有不確定性[3]。目前發現可降解聚乙烯材料的微生物主要為細菌和真菌類,其中真菌以霉菌為主,多為曲霉屬真菌。李夏等[13]發現桔青霉(Penicilliumcitrinum)有降解低分子量和高分子量聚乙烯粉末的作用,能快速降解侵蝕傳統聚乙烯地膜和聚酯類生物降解地膜。Khan等[14]從土壤中分離出一株土曲霉(Aspergillustubingensis),發現其可在聚酯類薄膜上生長并能夠降解該類薄膜。Yoshida等[15]從暴露于PET的天然微生物群落中分離出一株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum),發現其能降解PET材料。Das等[16]從固體土壤中分離出的2株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)BSM-1和BSM-2均能在短時間內降解線性低密度聚乙烯薄膜。

要解決青海省地膜殘留問題,最重要的就是篩選分離能高效降解聚乙烯材料的菌種資源。本研究將前期篩選到的一株有降解聚乙烯材料潛力的真菌 M2進行鑒定,通過測定地膜失重率,觀察膜片表面微觀特征、表面粗糙度、表面疏水性和表面官能團等變化情況,分析M2對聚乙烯地膜的降解能力,以期為微生物降解聚乙烯地膜提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、儀器與試劑

供試材料:地膜樣品為分子量2 000的白色透明聚乙烯地膜、黑色聚乙烯地膜;供試菌株M2由青海大學農林科學院植物保護研究所提供。

供試儀器:SQ510C高壓蒸汽滅菌鍋 (日本YAMATO公司),ZHPW-70恒溫培養搖床 (天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司),GTOP-1000D恒溫培養箱 (浙江托普儀器有限公司),MIRA LMS掃描電子顯微鏡(捷克TESCAN公司) ,SC7620濺射鍍膜儀 (英國Quorum公司) ,Dimension Icon原子力顯微鏡 (德國Bruker公司),Nicolet iS20傅里葉變換紅外光譜儀 (美國Thermo Scientific公司),JY-82水接觸角儀(承德鼎盛試驗機檢測設備有限公司)。

基礎無機鹽液體培養基(g·L-1)[17]:硫酸銨0.4 g,硝酸銨1.2 g,磷酸二氫鉀0.5 g,磷酸氫二鉀1.5 g,硫酸鎂0.5 g,氯化鈉0.5 g,酵母提取物0.05 g,調節pH為7.0～7.2。改良馬丁培養基 (g·L-1):酵母浸出粉2.0 g,葡萄糖20.0 g,蛋白胨5.0 g,磷酸氫二鉀1.0 g,硫酸鎂0.5 g,調節pH為6.4～6.6。以上培養基均在121℃條件下滅菌30 min。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 降解菌株鑒定 形態鑒定:將目的菌株M2接種在改良馬丁固體培養基平板上培養3～5 d,觀察菌株的形態特征并拍照,在載玻片上滴1滴無菌水,挑取生長期為5 d的目的菌株部分菌絲均勻涂抹于無菌水滴中,光學顯微鏡下觀察菌株的菌體形態、菌絲以及菌株的生長狀態并拍照。分子鑒定:選擇Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程股份有限公司),以目的菌株M2的基因組DNA作為模板,選擇真菌鑒定引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行 PCR擴增[18]。PCR反應條件為:94℃ 4 min;94℃ 45 s,55℃ 45 s,72℃ 1 min,30個循環;72℃延伸10 min。將PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。回收純化后由上海生工生物公司完成測序,獲取序列后,登錄NCBI網站選擇Blast窗口,輸入獲得的基因序列進行同源性序列比對,用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.2.2 供試樣品處理 將白色透明地膜與黑色地膜裁剪為5 cm×5 cm大小膜片,依次在滅菌的3% KCl 溶液、75 %酒精中振蕩浸泡30 min和15 min,期間用無菌水沖洗3次,最后置于超凈臺中用紫外燈照射1 h,自然風干后備用[13]。

無菌條件下,將培養好的M2菌株接種到含250 mL無機鹽培養基的三角瓶中,置于搖床里振蕩(150 r·min-1,30℃)培養5 d,設2個不接菌的無機鹽培養基作為對照,相同條件下培養,5 d后在無菌條件下將白色透明地膜與黑色地膜分別接入含M2菌株的處理組培養基以及不接菌的對照組培養基,培養30 d和60 d后分別取樣檢測菌株降解效果。

1.2.3 地膜失重率測定 為監測降解過程中地膜的重量變化,分別在培養10、30、50、60 d取樣測定地膜的失重率,試驗設置3個重復,以不接菌為對照。取出培養基中的地膜用去離子水反復淋洗,洗凈地膜表面附著的微生物膜,將洗凈的地膜在40℃的烘箱中干燥過夜,冷卻至室溫后稱重。地膜失重率按照下式計算:

失重率(%)=(菌株處理前地膜質量-菌株處理后地膜質量)/菌株處理前地膜質量×100%

1.2.4 地膜表面微觀特征觀察 將培養30、60 d的微量地膜樣品直接粘到導電膠上,并使用Oxford Quorum SC7620濺射鍍膜儀噴金45 s,噴金電流為10 mA;隨后使用TESCAN MIRA LMS掃描電子顯微鏡拍攝樣品表面形貌,觀察不同顏色膜片表面的微觀特征,包括是否出現裂紋以及孔洞等破損情況,形貌拍攝時加速電壓為3 kV,能譜mapping拍攝時加速電壓為15 kV,探測器為SE2二次電子探測器,放大倍數為2 000倍,拍攝標尺為5 μm,通過分析拍攝到的照片分析M2菌株對白色透明以及黑色地膜的降解效能。

1.2.5 水接觸角測定 將培養30、60 d的地膜樣品置于JY-82接觸角測試平臺,利用設備自動滴定系統滴上水滴,配備光源為可調背光平面平行光源,放大方式為可連續變焦,拍攝測試照片,用量角法測定靜水接觸角角度,進而分析M2降解下兩種膜片表面疏水性的變化[13]。

1.2.6 地膜表面化學官能團結構測定 將培養30、60 d的地膜樣品置于金剛石ATR模塊中,波數范圍600～4 000 cm-1,掃描32次,分辨率4 cm-1,傅里葉紅外光譜儀測定膜片表面的官能團,用Origin分析紅外色譜圖,分析降解后膜片表面是否引入新的極性官能團[19]。

2 結果與分析

2.1 降解菌株M2的鑒定

形態鑒定:經過5 d的培養,菌株M2在改良馬丁培養基上菌落近圓形,呈絨毛狀,生長初期為白色(圖1A,見222頁),生長后期為淡紫色(圖1B,見222頁);光學顯微鏡下分生孢子梗呈樹狀,各分支頂端含小梗(圖1C,見222頁)。

注:A: M2生長前期菌落形態;B: M2生長后期菌落形態;C: M2顯微形態。

通過PCR擴增,從菌株M2獲得1 294 bp基因片段;經過裁剪后,利用MEGA 7.0的鄰近法構建系統發育樹,菌株M2(登錄號:MW686879.1)與淡紫紫孢菌(GU980027.1)聚為同一分支(圖2)。因此,結合形態學特征和分子鑒定結果,M2鑒定為淡紫紫孢菌Purpureocilliumlilacinum(異名:淡紫擬青霉Paecilomyceslilacinus)。

2.2 不同顏色地膜失重率分析

聚乙烯地膜的表觀降解速率可通過比較地膜的干質量損失來評估。由圖3可知,黑色地膜的失重率高于白色透明地膜,經過60 d的M2降解,白色透明地膜失重率為7.27%,而黑色膜片的失重率可達8.45%。對照組地膜的少量質量損失可能為其清洗轉移時的損失。由此可初步推測,菌株M2對聚乙烯地膜具有較好的降解作用。

圖2 菌株M2 的系統發育樹圖

2.3 不同顏色地膜表面微觀特征分析

用掃描電子顯微鏡觀察降解30、60 d后的地膜,由圖4可見,經過30 d的M2降解處理,未接菌處理的白色透明地膜對照組(CK1)表面光滑平整,經過M2降解的白色透明地膜(T1)出現一定程度的破損;經過M2降解60 d后,T1表面開始出現凹槽和孔洞。由圖5可見,菌株M2降解30 d后,與未接菌處理的黑色地膜(CK2)相比,接菌處理的黑色地膜(T2)表面變得明顯粗糙,出現較多的微小裂紋與破損,局部高低不平;經過60 d的降解后,T2表面出現的褶皺和孔洞更加明顯。結果說明菌株M2對黑色地膜的降解效果更好。

注:CK1:未接菌的白色透明地膜;T1:經過M2降解的白色透明地膜;CK2:未接菌的黑色地膜;T2:經過M2降解的黑色地膜。下同。

圖4 降解前后白色透明地膜表面的掃描電鏡觀察結果

圖5 降解前后黑色地膜表面的掃描電鏡觀察結果

2.4 不同顏色地膜降解前后疏水性分析

地膜的主要成分是聚乙烯,聚乙烯是一種非極性疏水材料,測定膜片表面的水接觸角能了解膜片表面疏水性的變化,而疏水性降低是地膜被降解的重要特征[20]。如表1所示,經過30 d的搖床培養,未接菌的白色透明地膜平均水接觸角為85.70°,經M2降解后白色透明地膜T1的平均水接觸角降至83.60°;搖床培養60 d后,白色透明地膜的平均水接觸角由85.66°降至81.24°。經過30 d的降解處理,黑色地膜的平均水接觸角由91.66°降至84.36°;經過60 d的降解處理,黑色地膜的平均水接觸角由94.13°降至69.18°。由兩種膜片表面水接觸角的變化可以發現,黑色地膜經過M2降解后水接觸角顯著降低,說明其表面疏水性顯著降低,親水性提高,且隨著降解時間的延長,水接觸角降低幅度逐漸增大;而白色透明地膜疏水性降低幅度小于黑色地膜,說明菌株M2對黑色地膜的降解效果更好,與掃描電鏡結果一致。

2.5 不同顏色地膜紅外光譜圖分析

化合物的紅外光譜圖可以反映物質所含的官能團種類。將地膜洗凈后使用傅里葉紅外光譜儀進行化學官能團結構分析,可以推斷化合物的結構。聚乙烯是由乙烯和少量α-烯烴共聚而成,化學結構穩定,因而其難以降解,聚乙烯塑料地膜初步發生降解時,會在外來微生物的作用下引入極性官能團,從而增加其結構的不穩定性,以便后續的降解發生[13]。圖6是未經M2降解處理以及M2降解處理30、60 d后白色透明地膜的紅外圖譜。3 200～3 400 cm-1區域屬于羥基C-OH的伸縮振動,1 000～1 100 cm-1區域屬于醚鍵C—O—C的伸縮振動,經過30 d的M2降解,T1在3 200～3 400 cm-1和1 000～1 100 cm-1處吸收峰增強幅度均較小;經過60 d的降解,T1在3 200～3 400 cm-1區域吸收峰無明顯變化,而在1 000～1 100 cm-1區域吸收峰顯著增強,說明白色透明地膜中在降解過程中引入的官能團以醚鍵C—O—C為主。

圖7為未經M2降解處理以及M2降解處理30、60 d后黑色地膜的紅外圖譜。經過30 d的降解,T2在3 200～3 400 cm-1的區域吸收峰無明顯變化,而在1 000～1 100 cm-1附近吸收峰出現一定程度的增強,說明M2在降解黑色地膜過程中引入了新的極性官能團醚鍵 C—O—C;經過60 d的降解,T2在3 200～3 400 cm-1和1 000～1 100 cm-1附近吸收峰均明顯增強,說明M2在降解黑色地膜過程中引入了羥基C—OH和醚鍵C—O—C。兩種地膜的處理組與對照組紅外圖譜的差異表明M2對這兩種顏色的聚乙烯地膜都有降解侵蝕能力,而經M2降解的黑色地膜特征峰強度顯著高于白色透明地膜,表明M2對黑色地膜的結構穩定性影響更大,更易降解黑色地膜。

表1 降解前后白色透明地膜與黑色地膜水接觸角的變化/(°)

圖6 白色透明地膜傅里葉紅外光譜分析結果

圖7 黑色地膜傅里葉紅外光譜分析結果

3 討 論

聚乙烯地膜是我國農業生產常用的物質資料之一,其帶來巨大收益的同時也對環境造成嚴重污染。青海地區海拔高,氣候冷涼,降水較少,土壤肥力處于中等偏下水平,保水保肥能力較差,耕層淺而貧瘠,在實際農業生產中常應用雙色聚乙烯地膜增溫保墑[7,21-24],由于聚乙烯難以自然降解且不易回收,極易造成“白色污染”。為緩解該地區農田“白色污染”問題,本試驗以農業生產常用的白色透明、黑色聚乙烯地膜為研究對象,探究降解菌株M2對這兩種顏色地膜的降解能力。

經形態學及分子鑒定,M2是一株淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)。淡紫紫孢菌是一種食線蟲真菌,多用于防治植物寄生線蟲,淡紫紫孢菌制劑已被廣泛用于防控線蟲病害[25-29]。目前聚乙烯降解菌株主要為曲霉屬真菌[30],關于淡紫紫孢菌降解聚乙烯方面的研究尚不多見。本研究通過掃描電鏡、水接觸儀和傅里葉紅外光譜儀測定兩種顏色聚乙烯膜片被M2降解后的表面微觀特征、表面粗糙度、表面疏水性和表面官能團變化,探究了淡紫紫孢菌M2對聚乙烯的降解能力。

本試驗通過測定地膜的干質量損失發現M2降解后,白色透明地膜失重率為7.27%,黑色膜片的失重率可達8.45%,直觀地體現了M2對地膜的降解能力。通過掃描電子顯微鏡觀察發現,經過30、60 d的降解,兩種地膜處理組膜片均出現不同程度的裂紋與孔洞,且隨著降解時間的延長,膜片表面孔洞與溝壑更明顯。白色透明地膜經過菌株M2的降解,平均水接觸角有一定程度的降低但降幅較小;而黑色地膜的平均水接觸角在降解后顯著降低,即疏水性顯著降低,說明黑色地膜表面在菌株M2的作用下可能被氧化產生了親水基團,有利于菌株大量附著,為其進一步降解地膜提供了條件[29]。通過傅里葉紅外光譜分析,黑色地膜在降解過程中被引入了新的極性官能團羥基C—OH和醚鍵C—O—C,而白色透明地膜僅被引入了醚鍵C—O—C,說明菌株M2更容易影響黑色地膜結構的穩定性。本研究證實了淡紫紫孢菌M2對聚乙烯地膜的降解能力,豐富了聚乙烯降解微生物的菌種資源,為進一步開展聚乙烯地膜微生物降解機制研究奠定了重要基礎。

4 結 論

將青海大學農科院植保所提供的一株有降解聚乙烯潛力的菌株M2作為研究對象,通過形態學特征和分子生物學方法鑒定其為淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)。經過M2降解后的白色透明地膜和黑色地膜,其表面水接觸角變小,親水性增加;表面微觀形貌發生了變化,產生了孔洞、裂痕和凹坑;M2在降解過程中引入了新的官能團羥基和醚鍵;通過測定地膜質量損失發現M2對白色透明地膜的降解率為7.27%,對黑色膜片的降解率可達8.45%。以上結果均表明M2可以降解白色透明和黑色聚乙烯地膜,且其對黑色地膜的降解能力更強。