新疆鹽堿地區鹽爪爪內生菌群落組成與分布格局研究

王慧楠,唐琦勇,顧美英,張志東,朱 靜

(1.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室,新疆 烏魯木齊 830091;2.農業農村部鹽堿土改良與利用(干旱半干旱區鹽堿地)重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830091;3.新疆師范大學生命科學學院,新疆 烏魯木齊 830054)

土壤鹽堿化是當今世界旱地農業面臨的重大生態環境問題。新疆被稱為世界鹽堿地博物館,該地區鹽堿土面積占中國鹽堿土總面積 (9 913萬 hm2) 的22.01%;其中,受不同程度鹽漬化危害的耕地面積占總耕地面積的30.12%。土地鹽漬化已嚴重限制和阻礙了旱區農業開發及可持續發展[1]。鹽爪爪 (Kalidiumfoliatum) 為藜科多年生灌木,多分布于南北新疆極端鹽堿的荒漠沙土中。作為一種典型鹽生植物,鹽爪爪可在鹽漬化環境中生長,能不斷從外界吸收大量鹽離子,具有改良鹽堿地土壤性質、降低土壤含鹽量和增加土壤有機質的作用[2],在干旱半干旱地區的水土保持、農作物的耐鹽育種以及鹽漬化土壤的改良等方面有重要的生態和經濟價值。

植物內生菌是指存活于健康植物組織內部,不引發宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物類群[3]。內生菌可改善植物生長狀況,提高其抵抗鹽堿、干旱和病蟲害等環境脅迫的能力[4-5]。目前,關于鹽爪爪的研究多集中于其形態解剖特點[6]、適鹽特性以及耐鹽分子機理等方面[7],新疆特殊環境微生物資源挖掘創新團隊前期對新疆干旱荒漠及核輻射污染環境中的鹽爪爪內生群落構成進行了初步研究[8-9],而新疆鹽堿環境下鹽爪爪內生菌的相關報道仍較為有限。因此,本研究采用高通量測序技術,通過研究新疆5個不同地區的鹽爪爪內生群落結構組成與分布格局,以期闡明內生菌在生態系統的演替規律、生物多樣性及其生態功能,旨在為開發和利用相關功能微生物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集地點及方法

于2019年10月分別對新疆克拉瑪依市郊區(k)、吐魯番地區艾丁湖沿岸(ad)、巴音郭楞蒙古自治州塔什店鎮水庫周邊(ts)、巴音郭楞蒙古自治州輪臺縣野云溝鄉荒漠鹽堿地(yy)、巴音郭楞蒙古自治州輪臺縣城外鹽堿地(lt)5個地區的鹽爪爪進行采集。每個地區選擇3個采樣點,各采樣點之間間隔約5 km(表1)。使用隨機采樣法,每個采樣點采集1株完整植物樣品,裝入滅菌的牛皮紙袋內,編號記錄,帶回實驗室于4℃儲存。將每個采樣點采集的植株分為地上部分(up:莖,葉)和根部(down)。5個地區,每區3株植物,每株植物分為地上部分和根部2個樣本,由于ts采樣點采集了4株植物,故共計32個樣本。

植物采樣的同時采集土壤樣品,使用土鉆從土壤表層0～15 cm鉆取土芯,每份土壤樣品由5份土芯混合而成,過2 mm篩,去除土樣中的石塊和植物根系等雜物,裝袋封口并做好標記,運回實驗室于4℃保存。

1.2 樣品表面消毒

參照Sun等[10]方法進行樣本表面消毒,將植物組織依次浸入75%乙醇1 min、3.3%次氯酸鈉5 min、75%乙醇0.5 min,經無菌水沖洗后用濾紙吸干備用。

表1 不同鹽堿地區采樣信息

1.3 基因組DNA提取和PCR擴增

將樣品的地上部分和根部分別研磨,采用CTAB方法提取樣本的基因組DNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量樣本DNA于離心管中,用無菌水稀釋至1 ng·μl-1。

以稀釋后的基因組DNA為模板,對細菌16S rRNA基因V3-V4區、真菌ITS1區進行擴增,擴增產物經純化回收,交由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成測序。

1.4 生物信息學分析

使用QIIME 1.9.1軟件對Illumina MiSeq測序平臺下機數據進行質控,利用Uclust(Uclust v1.1.579)軟件對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類[11],默認以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational taxonomic units),用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1.0)。使用QIIME軟件計算Shannon、Simpson、Chao1等多樣性指數。利用Bray-Curtis算法,使用R 3.6.1版本(R Development Core Team, 2016)的vegan軟件包進行無度量多維標定(Non-metric multi-dimensional scaling,NMDS)分析群落之間的差異性。利用CANOCO 5.0軟件,使用冗余分析(Redundancy analysis,RDA)評價植物內生菌群落結構與環境變量之間的相關性。使用諾和云平臺(https://magic.novogene.com/)進行群落結構、物種多樣性等數據分析并繪制相關圖。使用IBM SPSS Statistics 27.0軟件對Alpha多樣性、土壤理化性質等數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

1.5 土壤樣品理化性質測定

2 結果與分析

2.1 測序數據分析

由各樣品測序信息結果(表2)可知,5個不同地區鹽爪爪地上部分和根部樣品總計測得內生細菌的原始序列664 331條,有效序列數616 931條;內生真菌的原始序列680 084條,有效序列數672 676條。以97%相似度將其聚類,內生細菌共產生366個OTUs,內生真菌共產生869個OTUs。如圖1(見261頁)所示,在內生細菌中,不同樣品及組織間共有的OTUs數為61,占總OTUs的16.67%。在內生細菌的366個OTUs中,地上部分僅包含111個OTUs,且主要來源于共有部分,而根部包含316個OTUs,表明根部樣品的OTUs更多。其中,地上部分樣品OTUs以ad組最多,約占地上部分總數的35.14%;根部樣品則以lt組OTUs最多,約占根部總數的24.05%。

表2 內生細菌和真菌測序數據統計

如圖2所示,內生真菌中,共有的OTUs為125,占總OTUs的14.38%。地上部分樣品共包含633個OTUs,根部樣品包含361個OTUs,可見在內生真菌群落中地上部分樣品OTUs高于根部樣品。其中,地上部分OTUs以lt組最多,約占地上部分總數的21.80%;其次為ad組,約占地上部分總數的21.17%。根部OTUs以ad組最多,約占根部總數的37.12%。以上結果說明,在不同地區的鹽爪爪中,內生細菌和內生真菌群落結構組成存在顯著差異。

2.2 多樣性及群落結構差異分析

2.2.1 多樣性分析 Alpha多樣性指標中的香農指數、辛普森指數可反映群落的多樣性,Chao1和ACE指數則反映群落的豐富度。由表3可以看出,測序深度指數coverage均在99.70%以上。在鹽爪爪內生細菌及內生真菌群落多樣性方面,不同地區及組織間香農指數及辛普森指數無顯著差異。在群落豐富度方面,所有地區的內生細菌基本表現為根部豐富度大于地上部分;內生真菌則相反,表現為地上部分豐富度整體大于根部。其中,ad組地上部分、lt組根部內生細菌群落豐富度最高;k組地上部分、ad組根部內生真菌群落豐富度最高。方差分析表明,各地區鹽爪爪的內生菌群落多樣性之間差異不顯著,而群落豐富度最高與最低組之間存在顯著差異。可見,不同地區的鹽爪爪內生菌群落多樣性狀況基本一致,但其群落豐富度在不同地區和不同組織間存在一定差異。

2.2.2 菌群結構分析 將OTU注釋到各分類水平,細菌產生的366個OTUs共涉及16個門,70個目,321個屬,以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)為主要菌門(圖3A)。進一步分析鹽爪爪樣品中12個主要屬發現(表4,見262頁),不同地區、不同組織的鹽爪爪內生細菌群落結構組成相近,但各樣品間菌群所占比例則存在顯著差異。其中,k地區的主要優勢菌屬為鏈霉菌屬(Streptomyces),ad地區以芽孢桿菌屬(Bacillus)、沉積物桿菌屬(Sediminibacillus)和海球菌屬(Marinococcus)為主要優勢菌屬,ts地區的優勢菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)和沉積物桿菌屬(Sediminibacillus),yy地區的主要優勢菌屬包括Kushneria屬和鏈單孢菌屬(Streptomonospora),lt地區相對含量較高的菌屬主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)和擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)。地上部分主要由嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、沉積物桿菌屬(Sediminibacillus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、薄壁芽孢桿菌屬(Gracilibacillus)組成;根部主要由芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈單孢菌屬(Streptomonospora)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Kushneria屬、海球菌屬(Marinococcus)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、鏈霉菌屬(Streptomyces)組成。

表3 內生群落多樣性指數

真菌產生的869個OTUs共涉及14個門,86個目,291個屬,以子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)為主要菌門(圖3B)。對鹽爪爪樣品中12個主要真菌屬作進一步分析發現(表5),與內生細菌的結果相同,不同地區、不同組織的鹽爪爪內生真菌群落結構組成相近,但各樣品間菌群所占比例也存在顯著差異。其中,k地區的優勢菌屬主要為葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)和格孢腔菌屬(Pleospora),ad地區的主要優勢屬為鏈格孢菌屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus),ts地區中相對含量較高的菌屬主要有鏈格孢菌屬(Alternaria)和支頂孢屬(Acremonium),yy地區的主要優勢屬為鏈格孢菌屬(Alternaria)、Neophaeosphaeria屬和莖點菌屬(Phoma),lt地區的主要優勢屬有鏈格孢菌屬(Alternaria)和糞殼菌綱未分類屬(unidentifiedSordariomycetes)。地上部分主要由葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)、鏈格孢菌屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、格孢腔菌屬(Pleospora)、莖點菌屬(Phoma)組成;根部主要由鏈格孢菌屬(Alternaria)、Neophaeosphaeria屬、支頂孢屬(Acremonium)、糞殼菌綱未分類屬(unidentifiedSordariomycetes)組成。此外,研究發現新疆鹽爪爪中存在著大量未分類細菌屬和真菌屬。

圖1 各樣本內生細菌群落韋恩圖

圖2 各樣本內生真菌群落韋恩圖

表4 屬水平上主要的內生細菌群落組成

表5 屬水平上主要的內生真菌群落組成

2.2.3 NMDS分析 基于OTU水平,對不同樣本內生細菌和內生真菌群落進行非度量多維尺度(NMDS)分析,其結果以stress值評估,即觀察到的距離和擬合距離的不一致性,stress值小于0.2時具有解釋意義。如圖4、圖5所示,各地區不同組織的內生細菌群落(ANOSIM:R=0.1902,P=0.003)和內生真菌群落(ANOSIM:R=0.2756,P=0.001)組成差異顯著。其中,5個樣品根部的點比較分散,說明根部內生細菌群落差異較大(stress值為0.170);地上部分內生細菌群落相對集中,說明其共有的細菌類型較多,群落構成相似度高。可見,地上部分和地下部分兩種不同的采樣位點對內生細菌的群落組成影響顯著。在內生真菌(stress值為0.165)中,yy組、lt組的根部以及k組的地上部分群落較分散,群落構成特異性高,而其他樣本雖相對集中,但樣品間真菌的群落構成依然差異顯著。

2.3 不同地區土壤屬性分析及其對群落組成的影響

土壤樣品理化性質的測定結果表明 (表6):不同地區土壤pH值均呈堿性;全鹽含量介于6.90～84.80 g·kg-1,屬于鹽堿土,其中ad地區的含鹽量最高;有機質含量基本介于4.30～10.90 g·kg-1,屬于荒漠土;地區間全氮含量差異不顯著;ts地區可溶性氮、速效磷、硫酸根含量均最高;yy地區的速效鉀含量最高,為563.00 mg·kg-1;lt地區鈣離子含量最高,為3.53 g·kg-1;電導率、鈉離子、氯離子與土壤全鹽量隨地區變化規律較一致,均為ad地區最高,yy地區最低。結果表明,除全氮含量外,不同地區間的土壤理化性質及含水量均存在顯著差異。

圖4 內生細菌群落NMDS分析(ANOSIM：R=0.1902 ,P=0.003 )

圖5 內生真菌群落NMDS分析(ANOSIM：R=0.2756 ,P=0.001 )

表6 土壤樣品理化性質

將各樣本細菌群落的主要門(top 10)及環境因子進行冗余分析(RDA),發現第一排序軸(RDA-1)對所有環境因子的解釋率為64.88%,第二排序軸(RDA-2)解釋率為30.73%,鈉離子(Na+)、速效磷(AP)、鈣離子(Ca2+)、可溶性氮(SN)是影響細菌群落的主要因子;土壤理化性質間呈正相關關系。鈉離子(Na+)與Firmicutes、Deinococcus-Thermus、Acidobacteria顯著正相關;速效磷(AP)、鈣離子(Ca2+)、可溶性氮(SN)與Firmicutes、Proteobacteria正相關(圖6)。除鈉離子(Na+)外(P=0.022),其他環境因子對優勢細菌門水平的影響均不顯著。

對各樣本內生真菌主要門(top 10)及環境因子進行冗余分析(RDA),發現第一排序軸(RDA-1)對所有環境因子的解釋率為95.87%,第二排序軸(RDA-2)解釋率為4.00%,氯離子(Cl-)、可溶性氮(SN)、pH、電導率(EC)是影響真菌群落的主要因子。氯離子(Cl-)、電導率(EC)與Mortierellomycota、Mucoromycota、Glomeromycota以及其他門呈正相關關系,其中,氯離子(Cl-)的影響較顯著(P=0.03)。pH除與Ascomycota呈正相關關系外,與其他門和環境因子均為負相關,但影響不顯著(圖7)。

3 討 論

鹽堿地因其含鹽量高、堿化嚴重、養分貧瘠、易板結、透氣性差等特點,使得大多數植物和微生物難以生存。鹽生植物可在鹽堿生境中不斷吸收鹽離子,降低土壤含鹽量,增加土壤有機質,從而改良鹽堿地土壤性質。然而,單獨的植物修復方法存在很多不足,比如修復效率低、專一性不強、只適用于中低濃度環境脅迫等。植物-微生物聯合修復成功彌補了單獨修復方法存在的缺陷,是一種更加有效的鹽堿地修復方式[12]。Bu等[13]研究表明,將從鹽地堿蓬中分離到的內生真菌接入水稻(OryzaSativa)后,水稻在Na2CO3脅迫情況下的生長能力和抗氧化性特征顯著增強。在鹽角草(Salicorniaeuropaea)應對鹽脅迫的研究中發現,內生菌可通過增強代謝活性顯著提高植物對鹽堿條件的適應能力[14]。因此,研究鹽生植物內生菌的群落結構及其與植物的共生互作機制,對于鹽漬化土壤的改良以及生物資源的開發利用具有重要的實際應用價值。

圖6 內生細菌群落組成 (門水平) 與環境因子的冗余分析

圖7 內生真菌群落組成 (門水平) 與環境因子的冗余分析

現有研究表明,植物的根和地上組織之間內生菌群落組成存在顯著差異。Dong等[15]通過對三七的內生菌進行研究,發現其根部的內生細菌α多樣性顯著高于莖和葉,且不同生長階段根部群落的特有成員數量明顯多于葉層群落。Chen等[16]的研究也發現,白首烏葉部內生真菌豐富度及多樣性均最高。Da Silva等[17]通過對菜豆的內生菌研究發現,不同品種菜豆內生真菌多樣性在器官和根際之間存在差異,根際最高,莖最低。以上研究表明,除了根和地上組織之間生化環境的差異外,二者的定植、共存機制以及組織間的流通限制也是造成群落差異的主要原因[18-19]。本研究通過高通量測序技術對新疆5個不同地區鹽生植物鹽爪爪進行分析,發現其地上部分的真菌多樣性和豐富度明顯高于根部,細菌多樣性和豐富度則明顯低于根部,這一結果與前期對新疆核輻射污染區鹽爪爪內生菌群落的報道一致[20]。本研究還發現,不同地區鹽爪爪地上部分內生細菌群落相對集中,群落構成相似度高,而根部內生細菌群落較為分散,特異性更高;內生真菌中,yy組、lt組根部及k組地上部分群落較分散,其他地區相對集中,但樣品間仍有差異,表明不同采樣部位對內生細菌群落構成影響顯著,對內生真菌群落影響不顯著。Zhang等[21]對極端環境下的穗狀雙針、苦艾、短柄白珠樹及毛梗霉植物進行了研究,指出土壤中的微生物種類通常多于地上組織。因此,根部細菌群落可能是通過土壤遷徙大量聚集形成的,而內生真菌的群落組成則受宿主和環境的限制更大[9]。

優勢菌能影響微生物群落的組成和結構,是決定微生物群落平衡的重要因素之一[22]。如Behairi等[23]指出高鹽生態系統擁有一個特定的微生物群,可以被鹽生植物招募,鹽堿干旱土壤中生長的鹽角草對招募的微生物群的多樣性產生了強烈的影響,其親和力強歸因于內生優勢菌嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。目前多數鹽生植物中的主要菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)及接合菌門(Zygomycota)[24-25]。本研究中,內生細菌門以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門為主,內生真菌門則以子囊菌門、擔子菌門為主;屬水平上分別以嗜鹽單胞菌屬(Halomonas),鏈格孢菌屬(Alternaria)為主要優勢屬。此外,內生細菌和內生真菌中存在的大量未知類群也占據了較大比例。這與大部分藜科植物內生菌的研究結果相似[8,26]。前期對新疆和碩縣烏什塔拉鄉周邊干旱荒漠地區地區的鹽爪爪內生真菌群落進行研究,發現炭角菌屬(Xylaria)為鹽爪爪內生真菌群落的絕對優勢種屬,這與本研究結果有所不同,因此推測不同區域、不同組織的鹽爪爪內生真菌群落組成存在一定差異,可能與菌群的選擇偏好性有關[9]。鹽單胞菌屬(Halomonas)屬于中度嗜鹽菌,該屬的成員大多對環境適應能力強,具有較高的耐鹽性能;Kearl等[27]研究發現將該菌接種于苜蓿幼苗后,在1.0% NaCl脅迫的情況下能刺激植株生長,使其恢復正常生長水平。此外鹽單胞菌屬的菌株還具有特殊的生物化學功能,如產胞外多糖、降解苯酚、降解原油、高產四氫嘧啶等,在工農業生產中發揮了重要作用。鏈格孢菌(Alternaria)在多種植物中存在,也有促進植株生長和提高鹽耐受性能的作用[28];除了具有酶促活性外,該菌還具有多種對抗人類病原微生物的抗菌活性,并能產生氨和吲哚乙酸(IAA)。Khalil等[29]的研究已將鏈格孢菌用作玉米的生物抑制劑,并取得了良好效果。這表明鹽爪爪內生菌中存在具有特殊功能的微生物資源,有很大的發掘和利用潛力。

土壤理化因子是微生物群落結構和組成的主要決定因素。相關研究發現,土壤pH、有機質、含鹽量是影響植物內生菌的主要因素[30],但在較高的分類層級上,植物的含鹽量及生長階段對鹽生植物內生菌群落組成影響不顯著[26]。本研究也發現,鈉離子(Na+)、氯離子(Cl-)和電導率(EC)與內生菌中的主要門呈正相關關系。與其他4個地區相比,艾丁湖地區(ad)的鈉離子(Na+)、氯離子(Cl-)含量最豐富,群落豐度最高,這可能是因為對耐鹽植物而言,鹽脅迫可增加根際土壤細菌多樣性和生物量[31],而該地區土壤鹽分含量顯著高于其他地區,鹽分的升高促進了耐鹽或嗜鹽細菌的增殖。土壤內生真菌大部分屬于好氧型,土壤含水量過高會抑制其生長與繁殖[32],這可能是造成輪臺地區(lt)真菌豐度偏低的主要原因。可見大多數植物內生菌群落組成除受宿主植物的影響外,還受到土壤理化特性的影響[19],兩者共同作用導致不同地區鹽爪爪內生菌群落組成的差異。此外,鹽爪爪是典型的鹽生植物,Na是其生長必需元素,鹽脅迫可以提高植物中鈉離子的含量。Akhter等[33]研究也發現種植鹽草能顯著降低土壤鹽分及pH,有效改善土壤環境及土壤肥力。由此可見,種植鹽生植物是鹽堿地生物改良的有效方法。

4 結 論

通過對新疆5個鹽堿地區的鹽爪爪根部和地上部分樣品的內生細菌及內生真菌進行分析發現,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)為主要細菌門,屬水平上,嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)的相對豐度最高;子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)為主要真菌門,屬水平上,鏈格孢菌屬(Alternaria)相對豐度最高。土壤中的鈉離子(Na+)與細菌Firmicutes、Deinococcus-Thermus、Acidobacteria呈顯著正相關關系,氯離子(Cl-)、電導率(EC)與真菌Mortierellomycota、Mucoromycota、Glomeromycota和其他門呈顯著正相關關系。不同地區、不同組織的鹽爪爪內生群落結構存在顯著差異,且與土壤鹽堿化相關。研究結果初步揭示了新疆鹽堿地區鹽爪爪內生菌群落結構組成與分布格局,對深入闡明內生菌在生態系統的演替、生物多樣性及其生態功能具有重要的科學意義。