菱葉繡線菊彩葉園藝品種‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉綠體基因組研究

張巧玲, 陳琳, 張淑燕, 顏海飛

菱葉繡線菊彩葉園藝品種‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉綠體基因組研究

張巧玲1, 陳琳1, 張淑燕2, 顏海飛3*

(1. 杭州西溪國(guó)家濕地公園生態(tài)文化研究中心，杭州 310013；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；3. 中國(guó)科學(xué)院華南植物園，廣州 510650)

基于菱葉繡線菊(×)培育出了很多的彩葉園藝品種，其中‘粉霜’彩葉繡線菊(‘Pink Ice’)和‘黃金噴泉’菱葉繡線菊(‘Gold Fountain’)是兩個(gè)性狀優(yōu)良的品種，這兩個(gè)彩葉品種的形成機(jī)制尚缺乏深入研究。該研究基于二代測(cè)序的淺層測(cè)序技術(shù)，對(duì)‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉綠體基因組進(jìn)行組裝、注釋、繪制其葉綠體基因組圖譜；結(jié)合網(wǎng)上已有的繡線菊屬植物的葉綠體全基因組開(kāi)展比較基因組學(xué)研究。結(jié)果表明，兩個(gè)品種的葉綠體基因組均為典型的四分體結(jié)構(gòu)，即含有1個(gè)LSC、1個(gè)SSC及2個(gè)IR；‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉綠體基因組大小分別為155 953和155 941 bp，各含有130個(gè)基因，包括85個(gè)蛋白編碼基因，37個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因和8個(gè)核糖體RNA基因；分別含有67、69個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列，其中，單核苷酸重復(fù)序列最多。篩選出這兩個(gè)葉綠體基因組內(nèi)7個(gè)高變異區(qū)域，分別為、、、、、、。菱葉繡線菊、‘粉霜’和‘黃金噴泉’雖有非常近緣的關(guān)系，但并未聚成單系。該研究首次獲得了兩種繡線菊屬彩葉品種的葉綠體基因組，為進(jìn)一步理解繡線菊屬及其彩葉園藝品種的親緣關(guān)系提供了大量有用信息，并為今后該屬更多園藝資源的發(fā)掘奠定了基礎(chǔ)。

繡線菊屬；園藝品種；葉綠體基因組；系統(tǒng)發(fā)育分析

葉綠體是植物細(xì)胞中一種半自主復(fù)制的細(xì)胞器，是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，能將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能進(jìn)行儲(chǔ)存，因此，葉綠體對(duì)植物乃至人類(lèi)的生存至關(guān)重要。目前，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為葉綠體的起源來(lái)源于真核細(xì)胞早期捕獲藍(lán)藻或光合細(xì)菌共生形成(內(nèi)共生假說(shuō)[1])。葉綠體基因組是葉綠體具有的獨(dú)立遺傳物質(zhì)，最早完成葉綠體基因組測(cè)序的物種為煙草()[2]與地錢(qián)()[3]。在早期，葉綠體基因組序列需首先提取葉綠體DNA，并隨機(jī)打斷或酶切后才能通過(guò)克隆和桑格測(cè)序技術(shù)獲得，獲取過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力[4]，隨后，通過(guò)設(shè)計(jì)大量保守引物及長(zhǎng)PCR方法[5]使葉綠體基因組學(xué)研究進(jìn)入了快車(chē)道。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，其測(cè)序數(shù)據(jù)通量和準(zhǔn)確率都得到了極大提升，而且測(cè)序費(fèi)用較為低廉，使該技術(shù)已普遍應(yīng)用于當(dāng)前的生物學(xué)研究中。基因組淺層測(cè)序是一種二代全基因組測(cè)序方法，可高效便捷地獲取基因組中高重復(fù)的基因或區(qū)域(如重復(fù)元件、核DNA的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)等)[5]。葉綠體基因組在光合組織中的含量較高，約為細(xì)胞內(nèi)總DNA含量的10%～20%[6]，因而基因組淺層測(cè)序技術(shù)可獲得高豐度的葉綠體基因組信息。此外，不斷發(fā)展的組裝及注釋技術(shù)[7–9]也使近年來(lái)葉綠體基因組數(shù)據(jù)呈爆發(fā)式增長(zhǎng)。

植物葉綠體基因組在園藝植物研究方面具有重要價(jià)值[6]，葉綠體基因組可用于園藝植物的起源、演化歷史及遺傳多樣性方面的研究。葉綠體基因組通常為單親遺傳(且絕大多數(shù)為母系遺傳)，其序列結(jié)構(gòu)及組成相對(duì)保守，核苷酸變異雖低于核基因但高于植物線粒體基因。葉綠體基因組的有效群體大小是雌雄異株植物的1/4或雌雄同株植物的1/2，因此葉綠體單倍型的固定時(shí)間及溯祖時(shí)間都較短，有利于我們發(fā)現(xiàn)其遺傳變異并追溯其演化歷史[6]。因此，葉綠體基因組在植物起源、演化歷史、遺傳多樣性、雜交方向等領(lǐng)域具有重要研究?jī)r(jià)值。葉綠體基因組有利于園藝植物的分子定向育種和雜交選育研究。葉綠素含量是植物葉片的重要生理指標(biāo), 但雜交育種或基因工程會(huì)導(dǎo)致核質(zhì)不親和或葉綠素合成不正常而形成花葉或白化，增加園藝植物的觀賞價(jià)值[6,10–11]。葉綠體的合成或質(zhì)體形成過(guò)程中的自發(fā)突變是導(dǎo)致一些園藝嵌合體植物[如天竺葵(×)、牽牛花()、紫茉莉()、大麗菊()等]花斑現(xiàn)象形成的原因[12]。最近，有研究比較了20種嵌合體植物的葉組織(綠葉組織和白化組織)的葉綠體基因組，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)葉綠體編碼的RNA聚合酶或光系統(tǒng)有關(guān)的基因中存在14個(gè)與白化現(xiàn)象產(chǎn)生相關(guān)的點(diǎn)突變[11]。

薔薇科(Rosaceae)繡線菊屬()是一類(lèi)具有重要園藝觀賞價(jià)值的植物類(lèi)群。根據(jù)最新的薔薇科分類(lèi)系統(tǒng)，繡線菊屬歸屬于桃亞科(Amygda- loideae)繡線菊族(Spiraeeae)[13–14]，為北溫帶分布的大屬，全球包含約90種(http://www.plantsoftheworld online.org)，間斷分布于歐、亞和北美洲地區(qū)。我國(guó)是繡線菊屬的現(xiàn)代分布和分化中心，多達(dá)70種(其中47種為我國(guó)特有[15])。因此，我國(guó)擁有豐富的繡線菊屬的種質(zhì)資源。繡線菊屬植物多為傘形、傘形總狀、復(fù)傘房或圓錐花序，多數(shù)種類(lèi)具有美麗的花朵、細(xì)致的葉片，生性強(qiáng)健，具有耐寒、耐旱、繁殖簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于花籬、花徑、花壇的栽植及園林主景的構(gòu)造[16]，是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的觀賞類(lèi)園藝植物。然而，我國(guó)繡線菊屬植物的園林應(yīng)用僅限于幾種常見(jiàn)種類(lèi)，與我國(guó)豐富的種質(zhì)資源十分不符。基于菱葉繡線菊(×)培育出了多種彩葉園藝品種，其中‘粉霜’彩葉繡線菊(‘Pink Ice’)和‘黃金噴泉’菱葉繡線菊(‘Gold Fountain’)是兩個(gè)性狀優(yōu)良的菱葉繡線菊品種，表現(xiàn)出較好的園藝價(jià)值。

近年來(lái)，繡線菊屬植物的葉綠體基因組研究得到了一些發(fā)展。目前，已公開(kāi)8種繡線菊屬植物的葉綠體基因組數(shù)據(jù)[14,17–23]，繡線菊屬葉綠體基因組具有典型的四分體結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為156 226～155 981 kb，編碼基因的數(shù)量變化較大，菱葉繡線菊有129個(gè)編碼基因[23]，而漸尖葉粉花繡線菊(var.)有125個(gè)編碼基因[22]，這可能是注釋不完整導(dǎo)致的，因此需進(jìn)行更詳盡的注釋及比較基因組學(xué)研究。此外，‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉色形成機(jī)制及與繡線菊屬其他植物的演化關(guān)系尚未開(kāi)展研究。鑒于葉綠體基因組在葉片色素形成及植物親緣關(guān)系及進(jìn)化方面的重要價(jià)值，本研究基于二代測(cè)序的淺層測(cè)序技術(shù)，對(duì)‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉綠體基因組進(jìn)行組裝、注釋、繪制其葉綠體基因組圖譜；結(jié)合網(wǎng)上已有的繡線菊屬植物的葉綠體全基因組開(kāi)展比較基因組學(xué)研究，探討‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉綠體基因組的組成及高變異位點(diǎn)；以及這兩個(gè)品種與繡線菊屬植物的親緣關(guān)系，為深入解析菱葉繡線菊及栽培品種的遺傳基礎(chǔ)和開(kāi)發(fā)繡線菊屬的園藝資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料和DNA測(cè)序

‘粉霜’彩葉繡線菊(憑證標(biāo)本號(hào)：Yan Hai-Fei Y1940)和‘黃金噴泉’菱葉繡線菊(憑證標(biāo)本號(hào)：Yan Hai-Fei Y1948)植株購(gòu)自浙江桐鄉(xiāng)四季花園家庭農(nóng)場(chǎng)，并栽種于杭州植物園。憑證標(biāo)本保存在中國(guó)科學(xué)院華南植物園標(biāo)本館。采集新鮮健康葉片保存在透氣的紙袋中，并放入帶有變色硅膠的封口袋中干燥保藏。在實(shí)驗(yàn)室采用CTAB法[24]從干燥葉片中提取總DNA，并在深圳華大基因股份有限公司(武漢)的MGISEQ-2000基因組測(cè)序平臺(tái)上開(kāi)展基因組淺層測(cè)序，獲得原始讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)(約2 Gbp)。

1.2 葉綠體基因組組裝及注釋

原始讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)在去除接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，使用軟件GetOrganelle v1.7.3.5[8]進(jìn)行葉綠體基因組的從頭組裝。將組裝好的序列使用在線注釋網(wǎng)站Geseq (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html[25])進(jìn)行基因注釋?zhuān)⒃贕eneious Prime 2019軟件[26]中進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖止ふ{(diào)整。通過(guò)線上工具OGDRAW v1.3.1 (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制葉綠體基因組序列物理圖譜[27]。

1.3 葉綠體基因組的比較分析

將葉綠體基因組導(dǎo)入Geneious Prime 2019軟件,比較葉綠體基因組總長(zhǎng)度及大單拷貝區(qū)(LSC)、小單拷貝區(qū)(SSC)和反向重復(fù)區(qū)(IR)的長(zhǎng)度、基因組成、GC含量等葉綠體基因組的基本信息。利用mVISTA在線軟件(https://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit. shtml)的Shuffle-LAGAN模型檢測(cè)葉綠體基因組的序列異質(zhì)性。利用在線軟件Reputer (https://bibiserv. cebitec.uni-bielefeld.de/repuer)鑒定葉綠體基因組的重復(fù)序列類(lèi)型(如正向重復(fù)、倒置重復(fù)、互補(bǔ)重復(fù)、回文重復(fù))[28]；其參數(shù)設(shè)置為：最小重復(fù)長(zhǎng)度設(shè)置為8，最小排列值為50。

1.4 葉綠體簡(jiǎn)單重復(fù)序列及核苷酸多態(tài)性分析

使用簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)識(shí)別軟件MISA[29]鑒定葉綠體基因組的單核苷酸、二核甘酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR；每種類(lèi)型最小重復(fù)參數(shù)設(shè)置依次為10、5、4、3、3、3；兩個(gè)SSR之間的最小距離設(shè)置為100 bp；當(dāng)兩個(gè)SSR之間的距離小于100 bp時(shí)識(shí)別為復(fù)合微衛(wèi)星(compound SSR)。核苷酸多態(tài)性分析采用DnaSP 6.0軟件[30]，窗口大小設(shè)置為500 bp，步移大小設(shè)置為200 bp。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI的GenBank中下載所有繡線菊屬物種的葉綠體基因組序列數(shù)據(jù)，以中華繡線梅() (MT683856)和華北珍珠梅() (NC_062461)為外類(lèi)群(表1)。本研究提取出所有葉綠體基因組中共有的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(Protein-coding genes, PCGs)，并采用MAFFT v7.308軟件[31]比對(duì)后形成串聯(lián)序列矩陣。利用RAxML v8.2.10軟件[32]序列矩陣進(jìn)行最大似然樹(shù)的構(gòu)建，核苷酸替代模型設(shè)置為GTRGAMMA，執(zhí)行1 000次重復(fù)自舉抽樣以獲得系統(tǒng)樹(shù)上每個(gè)分支的支持率。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)

‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉綠體基因組長(zhǎng)度分別為155 953和155 941 bp，均稍小于菱葉繡線菊(155 957 bp)，也小于絕大多數(shù)已知繡線菊屬植物，除毛枝繡線菊()和蒙古繡線菊()外(表1), ‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉綠體基因組與其他繡線菊屬物種的一致，均為典型的四分體結(jié)構(gòu)，即含有1個(gè)LSC、1個(gè)SSC和2個(gè)IR (圖1)。‘粉霜’葉綠體基因組的LSC、SSC和IR的長(zhǎng)度分別為84 384、18 883和26 342 bp，‘黃金噴泉’分別為84 395、18 860和26 343 bp。‘粉霜’與菱葉繡線菊葉綠體基因組的GC含量均為36.8%，而‘黃金噴泉’為36.7%，說(shuō)明繡線菊屬植物葉綠體基因組的GC含量相近。通過(guò)重新注釋并仔細(xì)檢查，除漸尖葉粉花繡線菊缺失基因外，該屬葉綠體基因組的基因組成高度保守。

表1 繡線菊屬葉綠體基因組的基本特征

2.2 葉綠體基因組的基因組成

基因注釋結(jié)果表明, ‘粉霜’與‘黃金噴泉’葉綠體基因組各含有130個(gè)基因，包括85個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，37個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因(tRNA gene)和8個(gè)核糖體RNA基因(rRNA gene)。這些基因可劃分成光合作用相關(guān)基因、自身表達(dá)相關(guān)基因和其他基因3類(lèi)(表2)。‘粉霜’與‘黃金噴泉’葉綠體基因組中這3類(lèi)基因的種類(lèi)和數(shù)量均完全一致。光合作用相關(guān)的基因均有45個(gè)，其中5個(gè)基因(F、B、D、A和B)含1個(gè)內(nèi)含子，B分布在IR上,因此具有2個(gè)拷貝。自身表達(dá)相關(guān)基因有61個(gè)基因, 其中C1、2、rps12、16、A、G、I、K、L、V均有1個(gè)內(nèi)含子，而P含有2個(gè)內(nèi)含子, 其中, 有15個(gè)基因分布于IR上(2237124.551623AIILNRV)，因此均有2個(gè)拷貝。其他基因中的1和2分布于IR上，均有2個(gè)拷貝，3含有2個(gè)內(nèi)含子。

表2 ‘粉霜’和‘黃金噴泉’葉綠體基因組的注釋基因及其歸類(lèi)

(2): 含有2個(gè)重復(fù)單元；*: 含有1個(gè)內(nèi)含子；**: 含有2個(gè)內(nèi)含子。

(2): Two repeat units; *: With one intron; **: With two introns.

圖1 ‘粉霜’和‘黃金噴泉’葉綠體基因組

2.3 重復(fù)序列及簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)分析

在‘粉霜’葉綠體基因組中共鑒定出49個(gè)重復(fù)序列，其中正向重復(fù)和回文重復(fù)各19個(gè)，反向重復(fù)9個(gè)，互補(bǔ)重復(fù)2個(gè); 在‘黃金噴泉’中鑒定出49個(gè)重復(fù)序列，其中正向重復(fù)和反向重復(fù)均與‘粉霜’一致，但回文重復(fù)和互補(bǔ)重復(fù)分別為20個(gè)和1個(gè); 在菱葉繡線菊中鑒定到49個(gè)重復(fù)序列，其中2個(gè)互補(bǔ)重復(fù)、21個(gè)回文重復(fù)、19個(gè)正向重復(fù)、7個(gè)反向重復(fù)(表3)。

‘粉霜’、‘黃金噴泉’和菱葉繡線菊的葉綠體基因組分別含有67、69和65個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(表4)。其中，單核苷酸重復(fù)序列最多，4堿基重復(fù)序列次之，2堿基重復(fù)序列均為6個(gè)。‘粉霜’葉綠體基因組有1個(gè)5堿基重復(fù)序列，而其余2種菱葉繡線菊均不存在這類(lèi)重復(fù)。本研究的3種菱葉繡線菊均不存在3堿基重復(fù)和6堿基重復(fù)，其葉綠體基因組的簡(jiǎn)單重復(fù)特征也基本反映了繡線菊屬的情況。

2.4 葉綠體基因組變異分析

以三裂繡線菊()的葉綠體全基因組為參考序列，利用mVISTA在線軟件基于Shuffle- LAGAN模型檢測(cè)繡線菊屬葉綠體基因組的序列異質(zhì)性(圖2)。結(jié)果表明, 繡線菊屬葉綠體基因組較為保守，特別是IR區(qū)的變異程度整體較低。變異多發(fā)生在大小拷貝區(qū)(LSC和SSC區(qū))，特別是基因間隔區(qū)(Intergenic spacers: IGSs)的變異信號(hào)更多。

使用DnaSP6軟件的滑動(dòng)窗口方法篩選‘粉霜’和‘黃金噴泉’葉綠體高變區(qū)域(圖3)，結(jié)果存在7個(gè)高變異區(qū)域，分別為HA、K、RA、TD、C、32和1。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)10個(gè)有葉綠體基因組數(shù)據(jù)的繡線菊屬物種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)。結(jié)果表明，除1個(gè)節(jié)點(diǎn)外，其余分支節(jié)點(diǎn)均有很高的支持率(>95%)；菱葉繡線菊、‘粉霜’和‘黃金噴泉’雖有非常近緣的關(guān)系，但并未聚成單系；菱葉繡線菊與繡球繡線菊()形成姐妹群，該分支再與‘黃金噴泉’組成姐妹關(guān)系，但其支持率非常低(37%)，其關(guān)系并未解決。

3 結(jié)論和討論

當(dāng)前，歐美國(guó)家已在原產(chǎn)于亞洲的繡線菊屬物種中進(jìn)行了大量的新品種培育，基于粉花繡線菊()培育出‘金焰’繡線菊(‘Gold Flame’)、‘金山’繡線菊(‘Gold Mound’)、‘魔氈’繡線菊(‘Walbuma’PBR)等大量園藝品種。菱葉繡線菊是麻葉繡線菊()和三裂繡線菊的人工雜交種，廣泛栽培于我國(guó)的山東、江蘇、廣東、廣西、四川[33]。基于菱葉繡線菊培育出了很多的彩葉園藝品種，其中‘粉霜’彩葉繡線菊和‘黃金噴泉’菱葉繡線菊是兩個(gè)性狀優(yōu)良的菱葉繡線菊品種，具有極高的園藝價(jià)值。我國(guó)是繡線菊屬的現(xiàn)代分布和分化中心，種類(lèi)多達(dá)70種(其中47種為我國(guó)特有種[15])，擁有豐富的繡線菊植物資源，但其園藝資源亟待開(kāi)發(fā)。繡線菊屬葉綠體基因組的研究還未深入開(kāi)展，據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅有8個(gè)繡線菊屬物種具有葉綠體基因組數(shù)據(jù)[14,17–23]。通過(guò)繡線菊屬葉綠體基因組學(xué)研究將有助于厘清該屬植物的遺傳資源及親緣關(guān)系，有利于進(jìn)一步發(fā)掘其園藝資源。

表3 繡線菊屬植物葉綠體基因組的重復(fù)序列

表4 繡線菊屬葉綠體基因組的簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR類(lèi)型

圖2 繡線菊屬植物葉綠體基因組的比對(duì)分析

圖3 ‘粉霜’和‘黃金噴泉’葉綠體基因組核苷酸多態(tài)性(Pi)的滑動(dòng)窗口分析

圖4 基于葉綠體基因組中編碼基因構(gòu)建的繡線菊屬植物最大似然樹(shù)。分支上的數(shù)字為支持率

本研究首次測(cè)序組裝并分析了繡線菊屬中兩種重要彩葉繡線菊‘粉霜’和‘黃金噴泉’的葉綠體基因組，發(fā)現(xiàn)這兩種彩葉繡線菊的葉綠體基因組均為典型的四分體結(jié)構(gòu)，即含有1個(gè)LSC、1個(gè)SSC和2個(gè)IR，并與其他繡線菊屬物種的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)一致，是植物葉綠體基因組中最常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)類(lèi)型[34]。‘粉霜’和‘黃金噴泉’葉綠體基因組分別為155 953和155 941 bp，是繡線菊屬葉綠體基因組中較小的。此外，本研究通過(guò)比較繡線菊屬葉綠體基因組，發(fā)現(xiàn)除漸尖葉粉花繡線菊缺失基因外，該屬的葉綠體基因組在基因組成和GC含量均較穩(wěn)定。一般而言，光合作用相關(guān)的基因以往在寄生植物中大量缺失，可能與寄生植物無(wú)需進(jìn)行光合作用有關(guān)[35–37]，而這類(lèi)基因的丟失現(xiàn)象近年來(lái)也在其他植物中發(fā)現(xiàn)，可能是由于其他基因(如核基因)發(fā)揮了其功能有關(guān)[38]。漸尖葉粉花繡線菊葉綠體基因組丟失基因的原因值得后續(xù)深入研究。

葉綠體基因組的編碼區(qū)序列進(jìn)化速率慢，因而相對(duì)保守，而基因內(nèi)含子及基因間隔區(qū)，以及簡(jiǎn)單重復(fù)序列均有較高的變異速率，葉綠體基因組內(nèi)不同的區(qū)域具有不同變異速率的特點(diǎn)非常適用于不同分類(lèi)階元的系統(tǒng)發(fā)育研究。例如，保守的編碼基因適用于科、目及以上分類(lèi)階元的系統(tǒng)發(fā)育分析[39]，而其非編碼區(qū)可用于近緣物種或種下的進(jìn)化研究[40]。葉綠體簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)是研究植物系統(tǒng)與進(jìn)化的重要遺傳標(biāo)記，主要為單核苷酸重復(fù)序列[41–42]。在本研究中，‘粉霜’、‘黃金噴泉’及菱葉繡線菊的葉綠體基因組均含有最多的單核苷酸重復(fù)序列，與以往的研究結(jié)果一致[41]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)4堿基重復(fù)序列也較多，為后續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。除葉綠體簡(jiǎn)單重復(fù)序列外，本研究使用滑動(dòng)窗口方法篩選出‘粉霜’和‘黃金噴泉’的7個(gè)高變異區(qū)域，這些高變位點(diǎn)有4個(gè)處于編碼區(qū)，其余位于基因間隔區(qū)。在這些高變位點(diǎn)中，HA和1在其他植物中也具有很高的變異，因此曾被推薦為DNA條形碼候選位點(diǎn)[43–44]。此外，其他片段也具有很高的變異率(特別是32)，說(shuō)明這些位點(diǎn)在繡線菊屬中具有作為DNA條形碼位點(diǎn)的潛力，為后續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究提供了重要研究方向。

本研究對(duì)10個(gè)有葉綠體基因組數(shù)據(jù)的繡線菊屬物種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明幾乎所有的分支節(jié)點(diǎn)均有很高的支持率(>95%)。在以往的研究中，菱葉繡線菊與繡球繡線菊、三裂繡線菊等具有非常近緣的親緣關(guān)系，但彼此的關(guān)系并未解決[45]。本研究支持以上結(jié)論，并進(jìn)一步厘清了這些種的關(guān)系，說(shuō)明繡線菊屬葉綠體基因組的蛋白質(zhì)編碼區(qū)已積累了較大變異，有充足的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)，為今后大規(guī)模開(kāi)展相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。菱葉繡線菊是麻葉繡球和三裂繡線菊的人工雜交種，本研究由于缺少麻葉繡線菊的樣品，并不能使用葉綠體基因組進(jìn)行雜交方向的判定，后續(xù)通過(guò)引入麻葉繡線菊的樣品將有助于解決上述問(wèn)題。本研究還發(fā)現(xiàn)，菱葉繡線菊、‘粉霜’和‘黃金噴泉’雖有近緣關(guān)系，但并未聚成單系，這說(shuō)明兩個(gè)菱葉繡線菊?qǐng)@藝品種可能分別通過(guò)雜交培育的，也可能是由于菱葉繡線菊(尤其是葉的顏色)經(jīng)歷了強(qiáng)烈的人工選擇，從而導(dǎo)致其葉綠體基因突變很快積累，并通過(guò)無(wú)性繁殖的方式保持了這種變異。葉綠體基因組研究可為我們進(jìn)一步理解繡線菊屬及其彩葉園藝品種的親緣關(guān)系提供大量有用信息，為今后發(fā)掘該屬更多有價(jià)值的園藝資源奠定了基礎(chǔ)。

[1] RAVEN J A, ALLEN J F. Genomics and chloroplast evolution: What did cyanobacteria do for plants? [J]. Genome Biol, 2003, 4(3): 209. doi: 10.1186/gb-2003-4-3-209.

[2] SHINOZAKI K, OHME M, TANAKA M, et al. The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome: Its gene organization and expression [J]. EMBO J, 1986, 5(9): 2043–2049. doi: 10.1002/j.1460-2075.1986.tb04464.x.

[3] OHYAMA K, FUKUZAWA H, KOHCHI T, et al. Chloroplast gene organization deduced from complete sequence of liverwortchloroplast DNA [J]. Nature, 1986, 322(6079): 572–574. doi: 10.1038/322572a0.

[4] FAN L J. Plant Genomics [M]. Beijing: Science Press, 2020: 181–183. [樊龍江. 植物基因組學(xué) [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2020: 181–183.]

[5] STRAUB S C K, PARKS M, WEITEMIER K, et al. Navigating the tip of the genomic iceberg: Next-generation sequencing for plant syste- matics [J]. Am J Bot, 2012, 99(2): 349–364. doi: 10.3732/ajb.1100335.

[6] RAUWOLF U, GOLCZYK H, GREINER S, et al. Variable amounts of DNA related to the size of chloroplasts: III. Biochemical determina- tions of DNA amounts per organelle [J]. Mol Genet Genom, 2010, 283(1): 35–47. doi: 10.1007/s00438-009-0491-1.

[7] DIERCKXSENS N, MARDULYN P, SMITS G. NOVOPlasty:assembly of organelle genomes from whole genome data [J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45(4): e18. doi: 10.1093/nar/gkw955.

[8] JIN J J, YU W B, YANG J B, et al. GetOrganelle: A fast and versatile toolkit for accurate de novo assembly of organelle genomes [J]. Genome Biol, 2020, 21(1): 241. doi: 10.1186/s13059-020-02154-5.

[9] SHI L C, CHEN H M, JIANG M, et al. CPGAVAS2, an integrated plastome sequence annotator and analyzer [J]. Nucl Acids Res, 2019, 47(W1): W65–W73. doi: 10.1093/nar/gkz345.

[10] GREINER S, RAUWOLF U, MEURER J, et al. The role of plastids in plant speciation [J]. Mol Ecol, 2011, 20(4): 671–691. doi: 10.1111/j. 1365-294X.2010.04984.x.

[11] PARK H S, JEON J H, CHO W, et al. High-throughput discovery of plastid genes causing albino phenotypes in ornamental chimeric plants [J]. Hort Res, 2022, 10(1): uhac246. doi: 10.1093/hr/uhac246.

[12] ZHOU Y, ZHOU H G, ZHANG X L. The study on variegation and chimerism in ornamental plants [J]. J Guangxi Agric Biol Sci, 1999, 18(4): 304–309. [周焱, 周厚高, 張西麗. 觀賞植物花葉現(xiàn)象研究現(xiàn)狀 [J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué), 1999, 18(4): 304–309.]

[13] POTTER D, ERIKSSON T, EVANS R C, et al. Phylogeny and classification of Rosaceae [J]. Plant Syst Evol, 2007, 266(1): 5–43. doi: 10.1007/s00606-007-0539-9.

[14] ZHANG S D, JIN J J, CHEN S Y, et al. Diversification of Rosaceae since the late Cretaceous based on plastid phylogenomics [J]. New Phytol, 2017, 214(3): 1355–1367. doi: 10.1111/nph.14461.

[15] WU Z Y, Peter H R. Flora of China, Vol. 9 [M]. Beijing: Science Press & St. Louis: Missouri Botanical Garden Press, 2003: 47–73.

[16] CHENG Y H, WU R H. Plant resource and application in garden ofin Heilongjiang Province [J]. For Invest Des, 2008(2): 62–63. [程銀虎, 武榮貴. 黑龍江省繡線菊屬植物資源及在園林中的應(yīng)用 [J]. 林業(yè)勘查設(shè)計(jì), 2008(2): 62–63.]

[17] QIN H, ZHU X X, ZHANG X, et al. Characterization of the complete plastome of(Rosaceae), a perennial shrub [J]. Mitochondrial DNA B, 2022, 7(1): 249–250. doi: 10.1080/23802359. 2021.2018948.

[18] YANG J Y, KANG G H, PAK J H, et al. Characterization and comparison of two complete plastomes of Rosaceae species (var.and) endemic to Ulleung Island, Korea [J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(14): 4933. doi: 493310.3390/ ijms21144933.

[19] SHEN W Y, LIN J, LIN H F. The chloroplast genome of(Rosaceae) [J]. Mitochondrial DNA B, 2022, 7(10): 1879– 1881. doi: 10.1080/23802359.2022.2135406.

[20] MA Y J, GUO Y P, ZHU Y, et al. The complete chloroplast genome ofmaxim [J]. Mitochondrial DNA B, 2021, 6(5): 1614–1616. doi: 10.1080/23802359.2021.1926351.

[21] HUO Y, YAN M, ZHAO X Q, et al. The complete chloroplast genome sequence ofG. Don (Rosaceae) [J]. Mitochondrial DNA B, 2019, 4(2): 3671–3672. doi: 10.1080/23802359.2019.1678434.

[22] WANG Q, CHEN M M, HU X F, et al. The complete chloroplast genome sequence ofvar.Franch. (Rosaceae) [J]. Mitochondrial DNA B, 2022, 7(1): 275–276. doi: 10. 1080/23802359.2022.2028590.

[23] CHEN M M, WANG R H, SHA H K, et al. The complete chloroplast genome sequence of×(Briot) Zabel (Rosaceae) [J]. Mitochondrial DNA B, 2022, 7(3): 505–506. doi: 10.1080/23802359. 2022.2052369.

[24] DOYLE J J, DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull, 1987, 19: 11–15.

[25] TILLICH M, LEHWARK P, PELLIZZER T, et al. GeSeq: Versatile and accurate annotation of organelle genomes [J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45(W1): W6–W11. doi: 10.1093/nar/gkx391.

[26] KEARSE M, MOIR R, WILSON A, et al. Geneious basic: An inte- grated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data [J]. Bioinformatics, 2012, 28(12): 1647– 1649. doi: 10.1093/bioinformatics/bts199.

[27] GREINER S, LEHWARK P, BOCK R. OrganellarGenomeDRAW (OGDRAW) version 1.3.1: Expanded toolkit for the graphical visuali- zation of organellar genomes [J]. Nucl Acids Res, 2019, 47(W1): W59– W64. doi: 10.1093/nar/gkz238.

[28] KURTZ S, CHOUDHURI J V, OHLEBUSCH E, et al. REPuter: The manifold applications of repeat analysis on a genomic scale [J]. Nucl Acids Res, 2001, 29(22): 4633–4642. doi: 10.1093/nar/29.22.4633.

[29] BEIER S, THIEL T, MüNCH T, et al. MISA-web: A web server for microsatellite prediction [J]. Bioinformatics, 2017, 33(16): 2583–2585. doi: 10.1093/bioinformatics/btx198.

[30] ROZAS J, FERRER-MATA A, SáNCHEZ-DELBARRIO J C, et al. DnaSP 6: DNA sequence polymorphism analysis of large data sets [J]. Mol Biol Evol, 2017, 34(12): 3299–3302. doi: 10.1093/molbev/msx 248.

[31] KATOH K, STANDLEY D M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: Improvements in performance and usability [J]. Mol Biol Evol, 2013, 30(4): 772–780. doi: 10.1093/molbev/mst010.

[32] STAMATAKIS A. RAxML version 8: A tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies [J]. Bioinformatics, 2014, 30(9): 1312–1313. doi: 10.1093/bioinformatics/btu033.

[33] LU L T. The evolution and distribution of subfam. Spiraeoideae (Rosaceae) of China, with special reference to distribution of the subfamily in the world [J]. Acta Phytotaxon Sin, 1996, 34(4): 361–375. [陸玲娣. 中國(guó)薔薇科繡線菊亞科的演化、分布——兼述世界繡線菊亞科植物的分布 [J]. 植物分類(lèi)學(xué)報(bào), 1996, 34(4): 361–375.

[34] WICKE S, SCHNEEWEISS G M, DEPAMPHILIS C W, et al. The evolution of the plastid chromosome in land plants: Gene content, gene order, gene function [J]. Plant Mol Biol, 2011, 76(3): 273–297. doi: 10.1007/s11103-011-9762-4.

[35] BRAUKMANN T, KUZMINA M, STEFANOVI? S. Plastid genome evolution across the genus(Convolvulaceae): Two clades within subgenusexhibit extensive gene loss [J]. J Exp Bot, 2013, 64(4): 977–989. doi: 10.1093/jxb/ers391.

[36] DONAHER N, TANIFUJI G, ONODERA N T, et al. The complete plastid genome sequence of the secondarily nonphotosynthetic alga cryptomonas paramecium: Reduction, compaction, and accelerated evolutionary rate [J]. Genome Biol Evol, 2009, 1: 439–448. doi: 10. 1093/gbe/evp047.

[37] GRAHAM S W, LAM V K Y, MERCKX V S F T. Plastomes on the edge: The evolutionary breakdown of mycoheterotroph plastid genomes [J]. New Phytol, 2017, 214(1): 48–55. doi: 10.1111/nph. 14398.

[38] MOHANTA T K, MISHRA A K, KHAN A, et al. Gene loss and evolution of the plastome [J]. Genes, 2020, 11(10): 1133. doi: 10.3390/ genes11101133.

[39] SOLTIS D E, SMITH S A, CELLINESE N, et al. Angiosperm phylogeny: 17 genes, 640 taxa [J]. Am J Bot, 2011, 98(4): 704–730. doi: 10.3732/ajb.1000404.

[40] YAN H F, ZHANG C Y, WANG F Y, et al. Population expanding with the phalanx model and lineages split by environmental heterogeneity: A case study ofin subtropical China [J]. PLoS ONE, 2012, 7(9): e41315. doi: 10.1371/journal.pone.0041315.

[41] EBERT D, PEAKALL R. Chloroplast simple sequence repeats (cpSSRs): Technical resources and recommendations for expanding cpssr discovery and applications to a wide array of plant species [J]. Mol Ecol Resour, 2009, 9(3): 673–690. doi: 10.1111/j.1755-0998.2008. 02319.x.

[42] YAN H F, PENG C I, HU C M, et al. Phylogeographic structure of(Primulaceae) inferred from chloroplast micro- satellites (cpSSRs) markers [J]. Acta Phytotaxon Sin, 2007, 45(4): 488–496. doi: 10.1360/aps06214.

[43] DONG W P, XU C, LI C H, et al., the most promising plastid DNA barcode of land plants [J]. Sci Rep, 2015, 5: 8348. doi: 10.1038/ srep08348.

[44] KRESS W J, ERICKSON D L. A two-locus global DNA barcode for land plants: The codingL gene complements the non-codingspacer region [J]. PLoS ONE, 2007, 2(6): e508. doi: 10.1371/ journal.pone.0000508.

[45] YU S X, GADAGKAR S R, POTTER D, et al. Phylogeny of(Rosaceae) based on plastid and nuclear molecular data: Implications for morphological character evolution and systematics [J]. Perspect Plant Ecol Evol Syst, 2018, 34: 109–119. doi: 10.1016/j.ppees.2018. 08.003.

Chloroplast Genome Analyses ofבPink Ice’ and ‘Gold Fountain’

ZHANG Qiaoling1, CHEN Lin1, ZHANG Shuyan2, YAN Haifei3*

(1. Hangzhou Xixi National Wetland Park Ecology & Culture Research Center, Hangzhou 310013, China; 2. College of Life Sciences, South China Agricultural University,Guangzhou 510642 China; 3. South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China)

Several foliage horticultural varieties have been bred based on, including ‘Pink Ice’ and ‘Gold Fountain’, which exhibit excellent horticultural traits. However, the underlying mechanism of these two colorful leaf varieties remain poorly understood. To address this knowledge gap, the complete chloroplast genomes of ‘Pink Ice’ and ‘Gold Fountain’ were assembled by using genome skimming sequencing. Comparative genomic analysis of all available chloroplast genomes of the genusto date was studied, including variation hotspot analysis, simple repetitive sequence analysis, and phylogenetic analysis. The results showed that both varieties had a typical quadripartite structure, consisting of one LSC, one SSC, and two IRs. The chloroplast genomes of ‘Pink Ice’ and ‘Gold Fountain’ were 155 953 and 155 941 bp in size, respectively, and each contains 130 genes, including 85 protein-coding genes, 37 transfer RNA genes and 8 ribosomal RNA genes. The two chloroplast genomes also contained 67 and 69 simple repetitive sequences, respectively, with single nucleotide repeat sequences being the most abundant. There were seven highly variable regions within these two chloroplast genomes, includingHAKRATDC32and1. Finally, phylogenetic analysis revealed that ‘Pink Ice’ and ‘Gold Fountain’ could not be considered a monophyletic group, despite their close relationship. Overall, these would provide valuable insights into the chloroplast genomes of two foliage varieties of, which would aid in the development of more horticultural resources for this genus in the future.

; Horticultural variety; Chloroplast genome;Phylogenetic analysis

10.11926/jtsb.4769

2023-01-04

2023-02-10

杭州西湖風(fēng)景名勝區(qū)(市園文局、市運(yùn)保委)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2018-006)資助

This work was supported by the Project for Science and Technology Development of the West Lake of Hangzhou (Grant No. 2018-006).

張巧玲(1982年生)，女，碩士研究生，從事植物應(yīng)用及濕地生物多樣性保護(hù)研究。E-mail: 3905397@qq.com

通訊作者 Corresponding author.E-mail: yanhaifei@scbg.ac.cn