兒童杜氏肌營養不良的基因診斷與臨床分析

劉洪欣 李珉 王昭聞

杜氏肌營養不良于臨床中又叫假性肥大型肌肉萎縮癥，屬于X 連鎖隱性神經肌肉相關疾病，主要特征為進行性的肌肉無力反應，在早期發病期間，患兒一般會出現走路失穩、容易跌倒情況，最終能夠累及患兒呼吸肌以及心肌，進而導致患兒死亡。杜氏肌營養不良患兒中，男性患兒數量明顯多于女性患兒[1]。根據國外統計研究發現[2]，大約每5 000 個男孩中，有1 個男孩會發生杜氏肌營養不良癥。從遺傳角度來看，杜氏肌營養不良的主要致病基因在于Xp21，其中共包括79 個外顯子[3]。本研究選擇2019年2月—2022年6月收治的50 例兒童杜氏肌營養不良患兒，通過多重鏈接依賴探針擴增技術（multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA）對患兒作基因診斷，應用Sanger 測序法對其診斷結果進行檢驗，分析患兒的臨床表現和該疾病的基因突變類型之間的關系，從而為患兒的早期診斷提供有力依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇湖北省麻城市人民醫院神經內科2019年2月—2022年6月收治的50 例兒童杜氏肌營養不良患兒。所有患兒經過《杜氏進行性肌營養不良的臨床實踐指南》標準確診[4]。本研究獲得醫院倫理委員會的批準。

納入標準：（1）患兒出現不明原因的血清肌酸激酶升高。（2）臨床表現主要包括運動發育遲緩、能力較差。（3）存在Gowers 征（+）。（4）患兒小腿部的腓腸肌存在假性肥大反應。（5）存在杜氏肌營養不良遺傳史。（6）通過肌電圖可確認患兒出現肌源性損傷。排除標準：（1）研究前使用過激素或免疫抑制藥物。（2）合并免疫性疾病。（3）患有遺傳疾病。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA 的提取

采集患兒以及其父親、母親的外周血3 mL，將其置入EDTA-K2 抗凝管中，提取DNA 后，需要做基因檢測。

1.2.2 基因檢測

檢測步驟包括：（1）DNA 的提取方法：通過苯酚-氯仿法進行提取，提取后，使用紫外分光光度計對DNA 的濃度進行測定。（2）MLPA 技術的檢測方法：在通過MLPA擴增后，應用對應試劑盒進行檢測，按照說明書上的操作進行變性、雜交、連接以及PCR 擴增。（3）MLPA 的數據分析：將正常人群的DNA 作為參照組，通過對比，確認目標杜氏肌營養不良癥基因是否發生突變反應。（4）通過Sanger 測序法驗證MLPA 的檢測結果。

1.3 觀察指標

（1）統計不同年齡段患兒的臨床表現，臨床表現內容包括運動落后、走路延遲；肌力降低；腓腸肌肥大；Gowers 征陽性；蹣跚步態、行走困難；肌電圖陽性。（2）統計患兒的血清酶檢測結果，包括乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine transaminase、ALT）、肌酸激酶（creatine kinase， CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）水平。（3）統計患兒的基因檢測結果。

2 結果

2.1 臨床表現

本研究收集的50 例患兒均確認為患有杜氏肌營養不良癥，其中47 例為男性患兒，3 例為女性患兒，患兒的就診年齡1 ～7 歲，平均（4.51±1.16）歲。早期發病的顯著性均不明顯，12 例患兒因為健康檢查中發現血清肌酸激酶水平明顯提升而受到重視，28 例患兒的運動發育速度相對較慢，如出現步態異常、蹲起困難、上下樓的難度高；38 例患兒因為存在其他疾病，通過住院檢查后發現其血清肌酸激酶水平明顯升高而受到重視。30 例患兒在通過體格檢查時，發現患兒的雙側下肢出現腓腸肌存在假性肥大反應；8例患兒通過體格檢查后，發現患兒的肌力存在程度不同的減退，隨著患兒的病情不斷進展，患兒的四肢端肌群產生了肌肉萎縮反應。見表1。

表1 臨床表現（例）

2.2 血清酶檢測結果

患兒血清中的LDH、AST、ALT、CK 水平出現程度不同的升高反應，其中血清CK 水平發生明顯升高。本研究中，患兒的CK 水平431 ～20 869 IU/L，與正常的CK 值比較，是其17 ～105 倍。見表2。

表2 血清酶檢測結果（U/L，n=50）

2.3 基因檢測

患兒通過杜氏肌營養不良基因檢測后發現，80.0%（40/50）患兒的外顯子發生缺失突變反應，20.0%（10/50）患兒為重復性突變。所有患兒的MLPA 結果通過Sanger測序法進行驗證。女性患兒的監測結果表示，外顯子18 ～37 發生缺失突變反應。所有患兒的MLPA 基因檢測結果均經過Sanger 測序技術進行驗證，結果為一致。

3 討論

杜氏肌營養不良患兒的早期發病相對隱匿，主要的發病人群為3 ～5 歲的小兒人群，早期發病后，患兒的動作相對笨拙，逐漸出現學步延遲、上下樓梯困難、蹲起困難、行走困難等情況。通過體格檢查后可以發現患兒的腓腸肌處于肥大狀態[4-5]。隨著患兒的病情不斷發展，等到患兒年齡增長到7 ～12 歲后，其行走能力會徹底喪失，等到了20 歲后，患兒會出現呼吸障礙、心力衰竭等嚴重性并發癥，最后導致其發生死亡[6]。杜氏肌營養不良患兒血清中的LDH、AST、ALT、CK 水平和正常指標相比更高，并且其中CK 的升高幅度最高[7]。其原因可能在于：缺乏抗肌萎縮蛋白，肌肉細胞發生壞死，大量該類酶從血漿中溢出而引發的[8]。本研究發現，患兒血清中的LDH、AST、ALT、CK 水平出現了程度不同的升高反應，其中血清CK 水平發生了明顯升高。本研究中，患兒的CK 水平為431 ～20 869 IU/L，與正常的CK 值比較，是其17 ～105 倍。

常規的杜氏肌營養不良基因檢測，通過PCR 擴增基因組中的單個外顯子，將其作為正常的等位基因，這不但消耗大量時間，且目標DNA 的需求量更多，不能夠顯示超過所使用探針的缺失[9]。MLPA 技術能夠對多個基因位點進行同時檢測，并且該技術的檢測成本較低，檢測靈敏度高，屬于國內外杜氏肌營養不良患兒的首選基因檢測方法。MLPA 檢測計數的最明確的優點就是可以重復性突變檢測杜氏肌營養不良的79 個外顯子，其也能夠對女性攜帶者進行檢測，并且能夠為其他家庭成員提供遺傳咨詢，并獲取相對準確的遺傳信息。所有患兒均采取MLPA 技術進行檢測，80.0%（40/50）患兒的外顯子發生缺失突變反應，20.0%（10/50）患兒為重復性突變。所有的患兒的MLPA 結果通過Sanger 測序法進行驗證[10-11]。女性患兒的監測結果表示，外顯子18 ～37發生缺失突變反應。所有患兒的MLPA 基因檢測結果均經過Sanger 測序技術進行驗證，結果為一致。但也有其他研究結果和本研究結果不同，其原因可能在于其他研究收集患兒的例數較少，且患兒所處地域各不相同[12]。MLPA 技術也具有一定局限性，主要在于該技術無法對點突變、小的缺失/ 重復性突變進行有效識別。如對患兒高度懷疑其患有杜氏肌營養不良，而通過MLPA 技術檢測結果為陰性患兒，可以采取基因全序列分析技術對杜氏肌營養不良基因進行檢測，確認其是否發生小片段突變以及點突變[13]。

杜氏肌營養不良的主要發病人群為男性患兒，女性一般為突變基因的隱形攜帶者，臨床表現并不明顯。本研究收集的50 例患兒均確認為患有杜氏肌營養不良癥，其中47 例為男性患兒，3 例為女性患兒，女性患兒的杜氏肌營養不良基因外顯子18 ～37 發生缺失，首發癥狀為雙側腿無力反應。臨床中關于杜氏肌營養不良女性患兒的致病機制在于X 染色體發生失活。還有一項越南的研究結果表明[14]，1 例因為雄性激素受體發生基因突變，從而引發女性患兒出現男性假兩性畸形反應。在存在臨床癥狀的女性肌營養不良攜帶者的研究中可以發現，X 染色體失活傾斜的程度和其表型的嚴重程度具有一定聯系，但X 染色失活是否和患兒的臨床癥狀嚴重程度具有一定關系尚未可知。目前臨床中關于女性杜氏肌營養不良患兒的研究文獻相對較少，且不同女性患兒之間存在的臨床表現具有較大的差異，一旦診斷不良，就會錯過最佳治療時機，影響了治療效果。

杜氏肌營養不良患兒的臨床表現和患兒的杜氏肌營養不良基因發生缺失是否存在聯系，其重點在于基因是否發生突變，突變后，是否能夠改變翻譯閱讀框架。大多數的突變導致閱讀框架受到破壞，主要是因為Dstrophin 的蛋白質發生丟失，從而導致患兒出現杜氏肌營養不良相關表現。若杜氏肌營養不良基因存在于閱讀框中發生基因突變，能夠形成截短并且存在一定額外功能的肌營養不良蛋白，導致患兒出現貝氏肌營養不良，該營養不良反應的臨床癥狀程度相對溫和[15]。本研究中納入的患兒中有4 例患兒存在智力降低情況，患兒的語言發育慢，其原因在于患兒機體中的抗肌萎縮蛋白相關復合物等亞型遭受破壞而引發的。其中的Dpl40 以及Dp71 可以在患兒腦部的中樞神經元中過高水平的表達。杜氏肌營養不良外顯子63 后發生突變的患兒，其神經精神障礙發生率更高，并且患兒的中樞神經系統受累的程度、頻率和遠端營養不良蛋白基因產婦的累積量具有密切聯系。發生杜氏肌營養不良的患兒，其發生注意力缺陷障礙以及孤獨癥等疾病的概率更高，給患兒的日常生活，甚至生命安全造成了極大的威脅。

對于杜氏肌營養不良患兒來說，第一，及時到醫院進行檢查，并及時經過治療，杜氏肌營養不良屬于隱性遺傳性疾病。因此，日常生活中，家長并沒有察覺到患兒是否患病，需到醫院進行及時檢查，若有患病的趨勢，就需要及時采取有效方法進行治療；第二，適當地進行運動訓練，杜氏肌營養不良患兒會產生肌肉萎縮反應，故適當地做運動訓練，可避免肌肉萎縮速度過快，若長期堅持，可增加肌肉的生長速度；第三，飲食需要忌口，此類患兒需要忌口的食物種類較多，如油膩性、生冷性、辛辣性以及刺激性的食物，以上食物對于患兒疾病的康復相對不利；第四，日常飲食需要保持清淡，同時還要攝入充足的營養，每天多食用蔬菜、水果、蛋類、魚類、豬肉，保證蛋白質的攝入；第五，經常輔導患兒，杜氏肌營養不良患兒會產生智力減退情況，因此，患兒的家屬需要輔導患兒，對患兒的術后康復相對有利；第六，保證愉快心情，大多數疾病的產生和負面情緒具有密切聯系，患兒長期處于過度緊張以及壓抑的狀態下，會產生較多其他疾病，因此，患兒盡可能保證每天心情愉悅。

目前，臨床中關于杜氏肌營養不良的治療，尚缺乏特效藥物以及特效療法，臨床中普遍采用糖皮質激素類藥物對患兒進行治療，可使其病情得到有效改善，同時和多種學科相結合，制訂綜合性護理干預。目前，杜氏肌營養不良臨床治療的重點在于從基因角度進行治療，國外已經逐漸采用兩種基因類藥物（ataluren、eteplirsen）治療患者，另外，還有多種藥物正在投入臨床試驗中。大部分杜氏肌營養不良患兒在發病早期，其血清中的肌酸激酶水平會發生升高，故在臨床工作中，首診醫生應該重點關注血清肌酸激酶水平明顯升高卻無其他原因可以解釋的患兒，并通過應用MLPA 技術對患兒做對應的基因檢測，及時做好診斷干預，使患兒的生存時間以及生存質量顯著提升，并且可以對患兒家屬作遺傳咨詢，實現優生優育，提升生育質量，且本文研究結果為《杜氏進行性肌營養不良的臨床實踐指南》后期標準制定提供了借鑒內容。

綜上所述，兒童杜氏肌營養不良通過基因診斷，其診斷價值高，可反映臨床分析情況，為臨床干預提供指導。