宏基因組二代測序技術在兒童重癥肺炎病原學診斷中的應用價值研究

周焱 周欣 齊旭升

肺炎是兒童常見的呼吸道感染性疾病, 其中重癥肺炎占7%～13%, 臨床表現為氣促、呼吸困難、持續性低氧血癥等, 易誘發呼吸衰竭、肺性腦病及多器官臟器功能衰竭, 近60%不良預后患兒不能明確病原體, 延誤治療［1］。致病菌的檢出對疾病的精確診斷、指導臨床用藥、減少住院時間、改善預后至關重要［2］。宏基因組二代測序(metagenomics next-generation sequencing, mNGS)作為新興的檢驗技術, 不依賴傳統的微生物培養, 不需要特異性擴增, 不需要預定假設,能一次性同時對上百萬條DNA 分子進行測序, 與信息庫進行對比分析, 即可明確樣本中所含病原微生物的種類及數量［3］, mNGS 繞過了微生物的分離及培養過程, 具有病原體檢出性率高、快速、準確等特點, 且不受抗生素及激素使用等因素的影響。目前mNGS 已逐步應用于臨床疑難感染性疾病的診斷, 對呼吸道感染、神經系統感染、血行感染、關節腔感染均發揮著顯著作用, 本研究旨在探討mNGS 技術對兒童重癥肺炎的臨床指導意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019 年10 月～2023 年1 月于本院兒科重癥監護病房(PICU)住院治療的71 例重癥肺炎患兒的臨床資料, 均行mNGS 檢測, 其中男43例, 女28例；月齡9.0(3.0～21.0)個月, 治愈出院62例。患兒家屬均簽署知情同意, 本研究獲醫院倫理委員會審核通過。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準 ①年齡<14 歲；②滿足重癥肺炎的診斷標準［4］；③樣本均送檢同一家公司(本研究送檢單位為華大基因公司)。

1.2.2 排除標準 ①原發性免疫缺陷；②肺部腫瘤性疾病；③心力衰竭導致的肺水腫；④臨床資料不完整。

1.3 研究方法

1.3.1 資料搜集 臨床資料收集包括性別、年齡、PICU 住院天數、是否有先天性心臟病、是否使用抗生素、是否機械通氣及治愈出院情況。實驗室檢測包括WBC、PLT、Hb、PCT、氧合指數、LDH。

1.3.2 檢測方法 取患兒的深部痰液或支氣管肺泡灌洗液作為標本, 均行mNGS 外送檢查, 同時行傳統病原學檢測(traditional pathogen detection, TPD)。規范采集mNGS 送檢標本, 樣本的儲存及運送標準參考專家共識［5］。送檢華大基因公司, 行病原微生物DNA 高通量測序, 根據測序結果與病原學文庫對比進行信息分析,得出最終報告。TPD 包括：①培養及形態學：痰液和支氣管肺泡灌洗液細菌及真菌培養、支原體培養、抗酸染色；②聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)：呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、鼻病毒、乙型流感病毒、博卡病毒、副流感病毒、偏肺病毒、EB 病毒、支原體、衣原體；③血清學檢測：腺病毒抗體、支原體抗體、EB 病毒抗體。

1.3.3 mNGS 報告解讀標準 mNGS 報告的解讀尚無統一標準, 本研究參考相關文獻［6］, 滿足以下至少1 條標準, 可認為是致病菌, 判定標準：①mNGS 與TPD 結果均提示為同種病原體, 并排除污染、定植因素；②mNGS 與TPD 結果不一致, 但根據患兒臨床表現、影像學表現、實驗室檢查綜合判斷符合該病原特點；③針對用藥后, 患兒病情緩解。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25 軟件對數據進行分析,符合正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t 檢驗；不符合正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距［M(P25, P75)］表示, 兩組獨立樣本采用Mann-Whitney U 檢驗。計數資料以率(%)表示, 組間比較采用χ2檢驗。一致性判定采用Kappa 檢驗, 顯著性比較采用配對χ2檢驗(McNemar test)。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mNGS 與TPD 病原體檢測結果比較 71 例患兒經mNGS 病原體檢測陽性66 例, 陽性率為93.0%；TPD 病原體檢測陽性51 例, 陽性率為71.8%；兩者病原體檢測結果一致性較差(Kappa=0.234), mNGS 病原體檢測陽性率顯著高于TPD, 差異具有統計學意義(P=0.001<0.05)。見表1。

表1 mNGS 與TPD 病原體檢測結果(n)

2.2 mNGS 與TPD 細菌檢測結果比較 TPD 細菌檢測陽性率為38.0%(27/71), 培養時間為(79.2±15.7)h；mNGS 細菌檢測陽性率為67.6%(48/71), 檢出時間為(54.0±16.9)h。兩者細菌檢測陽性率一致性較差(Kappa=0.299), mNGS 細菌檢測陽性率顯著高于TPD,檢出時間顯著短于TPD, 差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 mNGS 與TPD 細菌檢測結果(n)

2.3 mNGS 細菌檢測陽性的影響因素分析 71 例患兒經mNGS 細菌檢測陽性48 例(67.6%)作為mNGS 陽性組, 陰性23 例(32.4%)作為mNGS 陰性組。mNGS陽性組的月齡顯著小于陰性組, WBC、PLT 顯著高于mNGS 陰性組, 差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組性別、Hb、LDH、PCT、抗生素使用率、氧合指數、先天性心臟病發生率、機械通氣率、PICU 住院天數、治愈出院率比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 mNGS 細菌檢測陽性的影響因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

表3 mNGS 細菌檢測陽性的影響因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

注：與mNGS 陰性組比較, aP<0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

指標 mNGS 陽性組(n=48) mNGS 陰性組(n=23)性別(男/女) 29/19 14/9月齡(個月) 5.5(2.3, 18.8)a 18.0(3.0, 54.0)WBC(×109/L) 13.2(8.5, 18.6)a 9.6(5.7, 13.8)Hb(g/L) 107.6±17.4 110.5±24.3 PLT(×109/L) 466.2±258.7a 295.7±192.1 LDH(U/L) 364.2(309.6, 441.9) 413.9(338.6, 537.0)PCT(μg/L) 1.0(0.3, 3.6) 0.9(0.3, 6.7)抗生素使用 36(75.0) 15(65.2)氧合指數(mm Hg) 272.4±89.7 286.3±117.6先天性心臟病 20(41.7) 7(30.4)機械通氣 44(91.7) 18(78.3)PICU 住院天數(d) 9.0(6.0, 12.0) 8.0(6.0, 13.0)治愈出院 42(87.5) 20(87.0)

2.4 TPD 細菌檢測陽性的影響因素分析 71 例患兒經TPD 細菌檢測陽性27 例(38.0%)作為TPD 陽性組, 陰性44 例(62.0%)作為TPD 陰性組。TPD 陽性組的抗生素使用率55.6%(15/27)顯著低于TPD 陰性組的81.8%(36/44), WBC 顯著高于TPD 陰性組, 差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組性別、月齡、Hb、PLT、LDH、PCT、氧合指數、先天性心臟病發生率、機械通氣率、PICU 住院天數、治愈出院率并比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 TPD 細菌檢測陽性的影響因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

表4 TPD 細菌檢測陽性的影響因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

注：與TPD 陰性組比較, aP<0.05

指標 TPD 陽性組(n=27) TPD 陰性組(n=44)性別(男/女) 16/11 27/17月齡(個月) 6.0(2.0, 20.0) 9.0(3.0, 31.8)WBC(×109/L) 13.5(10.8, 22.5)a 10.0(6.1, 14.6)Hb(g/L) 105.8±17.1 110.3±21.3 PLT(×109/L) 414.0±206.5 405.4±275.0 LDH(U/L) 386.9(330.0, 447.4) 347.5(309.2, 471.6)PCT(μg/L) 1.3(0.4, 3.6) 0.7(0.3, 5.0)抗生素使用 15(55.6)a 36(81.8)氧合指數(mm Hg) 282.1±98.2 274.0±100.6先天性心臟病 9(33.3) 18(40.9)機械通氣 26(96.3) 36(81.8)PICU 住院天數(d) 10.0(5.0, 12.0) 8.0(7.0, 13.0)治愈出院 22(81.5) 40(90.9)

3 討論

肺炎是兒童死亡的主要原因之一［7］, 隨著抗感染藥物、免疫抑制劑、生物制劑的廣泛使用, 合并免疫缺陷的患兒生存率不斷增加, 機會致病菌的侵入使得感染病原體的種類也在發生相應改變。與其他傳染病一樣, 預后與及時充分的應用初始抗生素治療有關。兒童免疫功能低下、氣道狹短、黏膜屏障發育不完善極易患呼吸道感染, 但病原體沒有明確識別時往往很難進行針對性用藥, 病情短時間惡化, 會導致呼吸衰竭、嚴重膿毒癥、多器官功能衰竭等嚴重后果, 甚至死亡［8］。因此, 快速、準確識別病原微生物成為兒童重癥社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)精準抗感染治療的關鍵, 可顯著改善住院患兒最終預后［9］。

本研究中mNGS 對于致病菌的診斷效能明顯高于TPD, Kappa 檢驗提示兩者一致性較差, 提示mNGS 可以作為TPD 的補充, 但不能相互取代。細菌檢測方面, 本研究mNGS 細菌檢測陽性率顯著高于TPD(67.6%VS38.0%), 與李荷楠等［10］研究結果相近,感染細菌種類及耐藥性有較強的地域性［11］, mNGS 未能提供準確耐藥性報告, 需依據當地不同病原體耐藥性水平進行臨床調整用藥。本院重癥肺炎患兒以肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌為主要致病菌。值得注意的是, 對比傳統培養法, mNGS 對厭氧菌的檢測具有顯著優勢, 3 例患兒檢出放線菌, 此類病菌常定植于人的口腔黏膜、鼻咽、扁桃體等部位, 肺部感染少見, 當患兒免疫力低下時可機會性感染人體各個器官部位。肺放線菌病的臨床特征無典型表現, 主要表現為咳嗽、咳痰、呼吸困難等非特異性呼吸道癥狀, 極易誤診, 即使通過mNGS 已檢出放線菌核酸序列, 但肺部影像未見“空洞-懸浮氣泡征”等特征表現, 同時缺乏手術確診依據, 以常規抗感染治療后順利出院, 因此均未診斷肺放線菌病, 但其中1 例患兒出院后癥狀復發, 多次反復住院, 最終考慮肺放線菌病,開始長期用藥, 可見當臨床疑似肺放線菌病時可完善厭氧環境下培養并延長培養周期, 必要時采用纖維支氣管鏡下行組織病理活檢明確診斷, 以免漏診。本次常規細菌檢測主要為培養法, 陽性率低, 培養時間長達3～5 d, 相比本院mNGS 平均54 h 的報告時間, 明顯偏長, 且檢出病原體種類有限［12］, 如2 例百日咳桿菌、1 例惠普爾養障體均由mNGS 檢出。但隨著分子微生物學在下呼吸道細菌感染中的應用越來越廣泛［13］, 常見細菌, 如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌等, PCR 檢測逐漸興起, 對病原體的檢出起著重要的作用。既往研究表明, 入院前72 h 接受抗生素治療的患兒, PCR 檢測細菌病原體陽性率顯著高于培養法(78%VS32%), 且抗生素使用對PCR 檢出率的影響明顯小于傳統培養方法。mNGS 為核酸測序, 同樣受微生物活性及抗生素使用的影響較小［14-18］。本研究中, mNGS 陽性組的抗生素使用率(75.0%)與mNGS 陰性組(65.2%)比較, 差異無統計學意義(P>0.05)。但基于mNGS 無偏倚和高度敏感的特點, 檢測報告中可能會出現假陽性結果, 且難以區分下呼吸道病原體或定植菌, 如本研究中就有1 例患兒檢出結核分枝桿菌復合群, 檢出序列數為8, 但影像學、結核菌素試驗(PPD)、結核分枝桿菌核酸等檢測均不滿足該診斷, 因此考慮假陽性, 并予以排除。對于有菌部位的樣本臨床醫生需多方驗證, 將病原體與正常微生物和環境污染物區予以區分, 查閱參考既往文獻中相應病原體的致病報告, 另可采用PCR 技術對mNGS 檢出病原進行復核［19-23］, 而未能正確解讀報告將會導致誤診, 延誤患兒病情［24,25］。

綜上所述, mNGS 是未來危重癥感染患兒精準診療的發展方向, 可顯著提升兒童重癥肺炎病原體檢出率, 與TPD 互為補充, 是精準治療及避免抗生素廣覆蓋使用的關鍵, 對臨床合理用藥有重要指導作用, 做到早期識別, 早期干預, 進而改善患兒預后。